5.病毒粒子生产shRNA
优点:易于制备、纯化、浓缩,宿主范围广,感染率高,理化性质稳定,不整合宿主基因组,遗传毒性和免疫毒性低,是目前最好的RNA干扰技术之一。
缺点:耗费时间比较长,即使是用最快的也得60天左右,对实验条件要求较高,容量偏小,有可能伴随部分炎症反应。
适用于:转染效率低无法解决,需要维持较短时间的基因沉默的siRNA
不适用于:大量筛选siRNA或长时间的研究,主要原因是价格因素
评价:★★★★★
晶赛公司拥有一项未公布的病毒制备技术,可以在15天内完成shRNA病毒制备,价格接近shRNA制备的其他方法,将极有可能取代常规病毒表达shRNA的方法成为最佳的RNA干扰技术。
6.PCR制备shRNA表达框生产siRNA
优点:成本较低,方便快捷,可以用于有效序列的筛选,可以用于质粒载体构建。
缺点:转染效率低,不适合大规模制备。
适用于:筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于:长期抑制研究。(如果克隆到载体后就可以了)
评价:★★★☆☆
晶赛公司推荐给您的RNAi实验方法的参考模式:
1. 确立需要干扰的目标基因
2. 检查使用细胞的转染情况
可以选择一个4kb左右大小的质粒和可实施的转染方法,检测转染效率
转染效率超过40%:可以选择任何一种RNA干扰方法。
转染效率介于10%-40%:可以选用体外合成的si RNA或者带有筛选标记的shRNA质粒表达载体。
转染效率低于10%:带有筛选标记的shRNA质粒表达载体或病毒载体。
3. si RNA序列选择设计
制备20-30个si RNA序列,选择有效序列或委托专业化公司(如:晶赛生物)设计(3个序列保证1个有效)
4. 开始实验