主题：【讨论】高致癌物黄曲霉毒素的检测方法

我不用9分钟，因为有黄曲霉素B1快件试剂盒，我测过我买的花生米，正常，所以测后我放心地吃起花生米了。

找到一个需要60min的测试方法：

一、概要
黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液，动物饲料相关的产品中。黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的羟基化代谢产物，也是一种强致癌物质。牛乳及其制品是易受到黄曲霉毒素M1污染的食品之一。Aflatoxin M1的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)，薄层层析法(TLC)等。而使用黄曲霉毒素M1 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲霉毒素M1残留。
本试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代真菌毒素检测产品，操作时间短于60min，能最大限度地减少操作误差和工作强度。

二、试验原理
黄曲霉毒素M1检测试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被黄曲霉毒素M1抗原，样本中黄曲霉毒素M1和此抗原竞争黄曲霉毒素M1抗体，同时黄曲霉毒素M1抗体与酶标二抗相结合，经TMB底物显色，样本吸光值与其含有的黄曲霉毒素M1成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中黄曲霉毒素M1的含量。

三、黄曲霉毒素M1检测试剂盒适用范围:可定性、定量检测牛乳及其他乳制品等样本中的黄曲霉毒素M1。

四、使用单位需自备的设备及试剂
设备：
┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm
┅┅振荡器
┅┅离心机
┅┅天平：感量0.01g
┅┅微量移液器：单道 20l～200l、200l～1000l、多道 250l
┅┅刻度移液管：25ml
┅┅洗耳球
┅┅三角瓶：100ml
┅┅聚苯乙烯离心管：10ml/50ml
试剂：
----去离子水

五、提供的材料与试剂
组份名称、酶标板、高浓度标准品（810ppb）、AFM1酶标物、AFM1抗试剂、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液（10×）、AFM1浓缩样品/标品稀释液（4×） 注：试剂盒检测范围0.05ppb~4.05ppb

六、溶液的配制
配液1: 样品/标品稀释液
配液2: 洗涤工作液
配液3：6个不同浓度的标准液

七、样本前处理步骤
（一）牛奶
┅┅将含脂牛奶降温至10℃以下，于3500转/ min下离心10min；
┅┅用吸管弃去上层脂肪层，下层牛奶液即为待测液。（脱脂牛奶直接测定）
（二）奶粉
┅┅取5g奶粉于100ml三角瓶中，加入25ml蒸镏水；
┅┅振荡5min，使其完全溶解；
┅┅之后样品处理同牛奶样品处理方法。

八、检测步骤
测定前应须知：
1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20～25℃）。
2、使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。
3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
5、黄曲霉毒素M1可致癌，应戴手套操作。
操作步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2～8℃。不要冷冻。
3、洗涤工作液在使用前也需回温。
4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、加标准品/样本：加标准品/样本50l到对应的微孔中，加入AFM1酶标物50l/孔，再加入AFM1抗试剂50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境中反应。
6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300l/孔，充分洗涤5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。
7、显色：加入底物液A液50l/孔，再加底物液B液50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光环境反应15～20min。
8、测定：加入终止液50l/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。

九、检测方法灵敏度、准确度、精密度
试剂盒检测下限：0.05ppb
回收率：牛奶：90±15%
奶粉：85±15%
精密度：试剂盒的变异系数均小于10%

十、注意事项
1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、每加一种试剂前需将其摇匀。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6、储存条件：保存试剂盒于2～8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。
8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色时间为15～20min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到30min（或更长）。反之，则减短反应时间。
9、浓缩洗涤液如有结晶属正常现象，请加热溶解后使用。
10、该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

十一、贮藏条件及保存期
贮藏条件：保存试剂盒于2～8℃。
保存期：该产品有效期为12个月。

采用固相酶联免疫吸附ELISA的原理,即联免疫法,由光度计与B1试剂盒二大件组成,能限量、定量测定样品中黄曲霉毒素B1的含量,抗体与酶标抗原,待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应相结合,在特定波长滤光片的作用下,产生对光的吸收反应,达到灵敏、正确、快速、安全地检测AFB1,黄曲霉毒素的效果。

黄曲霉素还分B1、B2、M1、M2呢。

不知道大家听过胶体金免疫层析技术不？
这个方法从前处理到结果打印十几分钟，稳定性和回收率可以媲美试剂盒，并且更加快速便捷。比起试剂盒抗干扰性也更强。
步骤如下：
1）称取5.0g粉碎(20目过筛)的样品于50ml离心管中，加入25.0ml 70%甲醇水提取液，置于旋转摇床上旋转振荡提取5分钟(或用高速均质器均质1分钟，或用手剧烈振荡3分钟)，用定性滤纸过滤。
2）定量加入滤液于AFT微孔中，用移液器吸打混匀，取100μl加入到快检卡样品孔中。
3）反应10分钟后，立即将快检卡放入定量快检仪中，点击“分析”读数，即为样品实际浓度。

介绍完了，不知道大家觉得如何啊？

酶联免疫检测加上前处理时间大概要30min

高致癌物能快速检测吗

现在不是都用高效液相色谱法测吗