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主题：【分享】实验室常用技术参数——常用酶的配制

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发表于：2012/11/27 16:06:36 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

常用酶的配制

　　1．溶菌酶

　　用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分装成小份并保存于-20℃。每一小份一经使用后便予丢弃。

　　2．蛋白水解酶类

	贮存液	贮存温度	反应浓度	反应缓冲液	温度	预处理
				0.01mol/L Tris(pH7.8)
链霉蛋白酶^a	20mg/ml	-20℃（溶于水）	1mg/ml	0.01mol/L EDTA	37℃	自消化^b
				0.5% SDS
				0.01mol/L Tris(pH7.8)
蛋白酶K^c	20mg/ml	-20℃（溶于水）	50μg/ml	0.005mol/L EDTA	37～56℃	无须预处理
				0.5% SDS

　　a：链霉蛋白酶是从链球菌（Streptomyces griseus）中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。

　　b：自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下：把该酶的粉末溶解于10mmol./l Tris·HCl(pH7.5)、10mmol/l NaCl中，配成20mg/ml浓度，于37℃温育1h。经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中，保存-20℃。

　　c：蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）中纯化得到。该酶有两个Ca²⁺结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca²⁺，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA（以抑制依赖于Mg²⁺的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l Ca²⁺而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGT（pH8.0）至终浓度为2mmol/L,以鳌合Ca²⁺。

　　3．无DNA酶的RNA酶

　　将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/l Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

　　四、常用抗生素溶液

抗生素	贮存液^a		工作浓度
抗生素	浓度	保存条件	严紧型质粒	松弛型质粒
氨苄青霉素	50mg/ml(溶于水)	-20℃	20μg/ml	60μg/ml
羧苄青霉素	50mg/ml(溶于水)	-20℃	20μg/ml	60μg/ml
氯霉素	34mg/ml(溶于乙醇)	-20℃	25μg/ml	170μg/ml
卡那霉素	10mg/ml(溶于水)	-20℃	10μg/ml	50μg/ml
链霉素	10mg/ml(溶于水)	-20℃	10μg/ml	50μg/ml
四环素^b	5mg/ml(溶于乙醇)	-20℃	10μg/ml	50μg/ml

　　a：以水为溶剂的抗生素贮存液通过0.22μm滤器过滤除菌。以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。

　　b：镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如LB培养基）。

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