主题：维生素B12的液相检测

做cyancobalamin的同志很多吗。我也在做相关课题。HPLC法测定VB12确实很难。可以用SPE法纯化。再测

能说得具体一点吗，步骤怎样，如何纯化

一般作维B12含量通常用火焰原子吸收法，，高效液相色谱法，电热原子吸收法和动力学分光光度法或紫外分光光度法来作的，要看你现有仪器情况来作！！方法中只有紫外法最为简便而且成本也低，高效液相色谱法是最麻烦的方法

我这里有VB12纯化柱,使用它可以使得用HPLC方法检测VB12不再是难题.如有需要请联系 yongsheng84@163.com

北京泰乐祺喜迎十八大致力推出维生素B12检测新方法

  维生素B12一般被称为造血维生素，具有肌肤再生的优越效果，细胞再生与造血都少不了它，是促进人体新陈代谢的重要成分。 维生素B12是最新型的维生素，是所有维生素最后被发现的，分子构成最为复杂，人体中维生素B12含量会随着年龄的增加而逐渐减少，特别是女性因生理结构会减少的较快。 维生素B12参与体内甲基转换及叶酸代谢，促进5-甲基四氢叶酸转变为四氢叶酸。缺乏时，导致DNA合成障碍，影响红细胞的成熟。还促使甲基丙二酸转变为琥珀酸，参与三羧酸循环。此作用关系到神经髓鞘脂类的合成及维持有髓神经纤维功能完整，维生素 B12缺乏症的神经损害可能与此有关。近年来，由于人们对维生素B12的认识逐步加强，市场上保健品对维生素B12盲目添加，但过量的维生素B12会产生毒副作用。据相关报道，过量的维生素B12可出现哮喘、荨麻疹、湿疹、面部浮肿、寒颤等过敏反应，也可能相发神经兴奋、心前区痛和心悸。维生素B12摄入过多还可导到叶酸的缺乏。国家卫生部2102年3月15日发布了GB 14880-2012《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》，本标准将替代GB 14880-1994《食品营养强化剂使用卫生标准》并在2013年1月1日实施，本标准明确规定了维生素B12的限量标准，在调制乳粉（仅限儿童用乳粉）为10~30ug/kg,调制乳粉（仅限孕产妇用乳粉）10~66ug/kg,即食谷物，包括辗轧燕麦（片）5~10ug/kg；其他焙烤食品10~70ug/kg；饮料类0.6~1.8ug/kg；固体饮料类10~66ug/kg；果冻2~6ug/kg。



　　　北京泰乐琪携手相关企业和国家检测部门加强保健品、化妆品中维生素B12检测与监管保障人们安全，推出检测新方法，适用于片剂、胶囊、粉剂、功能性饮料类型保健食品中维生素B12的检测。本方法采取固相萃取法或免疫亲和色谱法对试样提取液中维生素B12进行富集并去除部分杂质，依据《GB/T5009.217-2008》应用免疫亲和法处理样品时，片剂、胶囊、粉剂取样量为2.0g，方法的检出限为0.05ug/g；功能性饮料取样量为20mL，方法的检出限为3.0ug/L。
免疫亲和法
1.试样处理
液体样品
1）碳酸型功能性饮料：取150mL样液于超声波中脱气10min,待用。
2）果粒或果汁型功能性饮料：用1mol/L氢氧化钠调PH至7.0，置离心机以转速4000r/min离心10min,过滤，滤液待用。
3）高脂性类奶油类：需先低温离心15分钟（2~8℃、3000转），除去脂肪层后直接将样品过柱。如果样品高粘稠还需用0.014M的PPS溶液进行稀释（按1:2-1:10的倍数）。
4）富含蛋白样品需预先除去蛋白。每5ml样品中加入20ul浓盐酸(36％)，在60℃温育45分钟。然后离心10分钟(3000转)，用1N的盐酸调节pH到7±0.5
固体样品
1）一般的水溶性样品可以溶解后直接分析。将样品溶解于双蒸水后，调节pH为7±0.5，注意要预先除去混浊物。
2）可以选择离心、过滤、Carrez试剂沉淀等方法净化样品。取样品溶液5ml分别加入250ul Carrez I 试剂和250ulCarrez II试剂，然后离心除去沉淀物。
3）难溶于冷水的样品，可通过温育加热使其溶解。
4）对于不溶性如谷物类样品，要先将样品进行粉碎成中细粒粉末，称取2g样品溶于10ml双蒸水中，振荡器上震荡30分钟（120次/分）。也可用磁转子混匀。然后将溶液过滤或在3000转离心5分钟，调节pH为7±0.5，然后用于过柱。
Car-rez-Ⅰ-溶液：溶解3.60g亚铁氰化钾（II）（K4[Fe(CN)6] *3H2O）到100ml蒸馏水中，室温储存。
Carrez-ⅠⅠ-溶液：溶解7.2g硫酸锌（ZnSO4*7H2O）到100ml蒸馏水中，室温储存。

富集 净化
维生素B12免疫亲和净化柱先用10mL水淋洗小柱中未键合的化合物，吸取20mL提取液上样到净化柱上，再用3mL甲醇洗脱维生素B12到蒸发皿中，整个过程速度约为1滴/s。于60~70水浴中蒸干溶剂，用1mL0.025%的三氟乙酸溶液溶解，溶液过0.45umg玻璃纤维滤纸，待高效液相色谱用。
维生素B12免疫亲和进化柱
（操作步骤：符合GB/T 5009.217-2008国标方法）
1）取出免疫亲和层析柱, 恢复至室温，将上方塞子取出剪断，再插回亲和柱上。
2）将免疫亲和柱上端连接于10mL注射器下（泵流操作架）。准确移取10mL样品提取液注入注射器，并取下柱底部的盖子。
3）将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体；
4）过完柱后用10ml蒸馏水到注射器清洗过柱，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体；
5）将干净的收集管放在柱子底部，准确加入1ml色谱甲醇到免疫亲和柱中，温育5分钟以上，流速为1- 2mL/min（本步骤基本重力过柱即可），收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。
注：如样品处理后仍然很粘稠，请加大离心力及离心时间，或者选择减少加入亲和柱中的样品量，避免出现亲和柱堵塞。
液相色谱参考分析条件
1）色谱柱C18（4.6mm*250mm,5um）反相色谱柱。
2）流动相：采用梯度洗脱方式,见表1
t/min    A:0.025%三氟乙酸（pH=2.6）    B：乙腈
0--3.5    100    0
3.5--11    75    25
11--19    65    35
19--20    90    10
20--30    100    0
流速1mL/min。
检测波长：361nm。
5）柱温：室温。
4.测定
吸取20uL标准溶液和试样溶液注入高效液相色谱中，以保留时间定性，用标准曲线法进行测定。
5.结果计算
按式（1）计算试样中维生素B12的含量。
      X=A*f/m
式中：
X--试样中维生素B12的含量，单位为微克每克或微克每毫升（ug/g或ug/mL）；
A--从标准曲线上查得的含量，单位为微克（ug）；
f--试样稀释倍数；
M--试样的取样量，单位为克或毫升（g或mL)。
计算结果保留两位有效数字。
6.精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。





7.色谱图
高效液相参考谱图


以下为我公司维生素B12检测相关产品订购信息：
产品货号    产品名称及规格    数量
IAC-101-3    Vitamin(e)12 Immunoaffinity Chromatography 维生素B12免疫亲和柱3ml，25支/盒    1盒
    Glass Microfiber Filters玻璃纤维滤纸    1盒
Pribofast KRC－25    Photochemical Reactor for Enhanced Detection Aflatoxin B1, B2, G1, G2； Pribofast KRC－25  230V 50 HzUVE 254 nm
lamp
Pribofast KRC 光化学柱后衍生反应系统，254nm纳米紫外灯    1套
ODS-150    HPLC-Column for Aflatoxin Analysis, C18 150 x 4.6 mm  
黄曲霉毒素专用液相色谱柱    1根
IAC-8 RACK    泵流操作架/免疫亲和柱操作架,用于免疫亲和柱样品净化操作
（含气泵 转换头等配件，多用连接头是选配）    1套
订购热线：010-63380700 63395349 52453171 13311089404
更多信息请联系：北京泰乐祺科技有限公司 市场部  
联系电话：  010-63380700 52453171 52453170 13311089404
公司网址:www.rapid-bio.com.com  
　　
注：作为面向全球提供霉菌毒素检测技术解决方案的主要服务商之一，PriboLab凭借强大的研发团队和霉菌毒素检测技术的研究，为全球农业生产、食品加工与粮食、饲料工业等行业提供专业

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