四、植物材料:水稻苗,叶鞘,根
1、200毫克样品置于冰上磨碎
2、加lysis buffer,离心,10000rpm,4度,5min取上清
3、重复离心5min
lysis buffer:urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
五、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸(丙酮配制,含10mM即0.07%β-巯基乙醇),混匀,-20℃沉淀1小时,4℃,15000 r/min离心15 min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇),再于-20℃沉淀1小时,同上离心弃上清,(有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl(可调) UKS液[9.5 M尿素,5mM碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫苏糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃温育30min,期间搅动几次,28度(温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心15 min,离心力越大时间长一点越好!上清即可上样电泳。或者-70度保存
六、植物根中蛋白质的抽取
(1) sample, 液氮研磨
(2) 装1.5 ml centrifuge 用tube
(3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite
(5) 取上层液,蛋白质就在里面