各位网友，在下想征集真蛋白的检测技术。80年代，曾有2种蛋白检测技术的诞生（可能不止两种，请大家集思广益），一种是凯氏定氮法，一种是杜马斯燃烧法。目前我们用的最多的是凯氏定氮法。
大家都知道，这两种方法都是以氮元素的量乘以相应的系数，得出蛋白的含量，是粗蛋白的含量。2008年的三鹿奶粉事件，就是因为不能检测真蛋白而发生的。
现在小弟在这个帖子中，征集各位大侠的检测方案。要求：
原理：
使用仪器：
检一个样的时长：
注意：每发一种新的检测帖，奖励30分，与楼上重复的不得分。各位先到先得了！![]()
==============================================非常感谢：hhciq对本帖的大力支持！送![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
，感谢xujing0202520的补充。现将hhciq及xujing0202520的回帖整理如下：请hhciq把把关，看有没有什么重复的。1、采用化学发光方法, 结合有效氮吸收装置,测定饲料中的粗蛋白质。静态注射化学发光法选用2.0×10-4mol/L的Luminol溶液,用量为2.00ml,待测液的用量为2.00ml。静态注射化学发光法简化了测试方法,缩短了时间,加标回收率为86.91%～104.60%,RSD<5%(n=5),适用于饲料生产部门的质量控制。 2、反相高效液相色谱法
反相高效液相色谱法通常采用低离子强度酸性有机冲洗液和烷基硅胶键合固定相， 影响分离的因素主要有流动相组成、洗脱湿度、洗脱液p H值、离子对试剂和流速等； 有利于分离的条件是低 p H值、流动相、室温或较高的温度及使用乙腈或异丙醇作为有 机部分，三氟乙酸 ( T F A)对于蛋白质及气相色谱公认是一种较好的流动相添加剂。 蛋白质的保留性质和选择性还与键合固定相的性质有关， 采用大孔硅胶和短链烷基 键合固定相在蛋白质分离中具有优势。3、正交轴逆流色谱法是新近发展起来的一种方法。 具体是：以n l ( 质量分数为 1 2 ． 5 ％ 的P E G 8 0 o 0 ) ：n l( 质量分数为2 5 ％的磷酸氢二钾)=1 ：1 或i n( 质量分数为 1 2 ． 5 ％的 P E G 8 0 0 0 ) ： m ( 质量分数为3 0 ％ 磷酸氢二钾) =1 ：1 为溶剂系统，以下相作流动相，上相 作固定相，操作时采用5 0 0 r ／ m i n的转速和6 0 0 ml ／ h的流动相流速。该方法在分离度不大 的基础上提高了进样量，适用于分离天然生物大分子。4、微乳液毛细管电动色谱分离法 ( ME E K c)
微乳液毛细管电动色谱分离法是在胶束电动色谱 ( ME K c)基础上发展起来的，在E K C中，分离载体为离子胶束，它由表面活性剂组成，不同的表面活性剂构成不同的胶束，因而具有不同选择性，若以水包油微乳液作为分离载体，则称之为ME E K C法， 该法是一种新型的分离技术，目前多用于小分子中性物质的分离。5、毛细管电泳法
电泳一直是研究蛋白质的重要方法。毛细管电泳除了具备凝胶电泳的高分辨力以 外，以其快速、定量、重复性好。灵敏度高及自动化程度高等诸多优点在近几年内成为 蛋白质分离分析一项崭新且重要的技术。 其分离机理是根据被分离物质的泳动率不同而 将其分开，毛细管电泳仪就是基于这个原理而设计的自动化分离分析样品的仪器，由于 毛细管电泳刚兴起，目前主要应用的模式仍是自由溶液毛细管电泳，虽然此法具备多项 优点，但仍有不足之处。首先它不能用于制备分离，再者当样品较稀时不能象H P L C那 样进样较多体积，使样品吸附在柱上，然后洗脱下来。 6、毛细管导电聚焦法 ( C mF )
C l E F法可用于分离等电点 ( P I )相差0 ． 1 2 p H单位的蛋白质，其基本步骤是：先在 毛细管内对蛋白质进行等电聚焦，然后对分离的蛋白质区带进行检测，按照迁移技术的 不同，分离方法可分为两步法、一步法、固定区带法。C l E F分离蛋白质应先解决基本 问题：消除或减少电渗的涂层方法、检测方法和条件，蛋白质区带的迁移及 P I测定方法，影响C I E F分离效能的因素，两性电解质的组成和浓度、毛细管长度、聚焦电压等。 7、反胶团萃取法
反胶团萃取分离蛋白质是一种新型的有发展前途的生物产品的分离技术。 它是利用 表面活性剂在有机溶剂中形成反向胶团，从而实施了对蛋白质的有效萃取，是表面活性 剂在生物工程中的一种成功应用。
8、累加进样分离法
它是指导蛋白质在梯度开始后的一段时间内可以多次重复进样而其保留值无可觉 察的变化的方法。实验证明：在洗脱液远离突跃点时，蛋白质可以多次重复进样而其保 留值与常规分离无明显的变化。 这种累加进样分离法在蛋白质的制各纯化中有重要的应 用价值，它可以提高有效柱容器，节省大量时间和消耗，在一次色谱分离中完成聚集和 分离两步操作，可用分析型仪器制各数量较大的样品。
9、凯氏( K j e l d a h 1 ) 定氮法
将被测试的样品与浓硫酸在硫酸铜和硫酸钾存在下共热消化， 含氮有机物即分解产生氨、二氧化碳和水， 氨与硫酸反应变成硫酸铵。消化后向消化液中加入强碱碱化使之分解放出氨，用水蒸气将氨蒸至硼酸液中， 用标准强酸溶液滴定收集氨的硼酸溶液， 即可计算出样品的氮含量， 从而折算出样品的蛋白质含量( 通常由含氮量乘以系数 6 ． 2 5计算出( 该系数为蛋白质平均含氮量的倒数) ， 乳制品通过乘以系数 6 ． 3 8计算出( 该系数为乳制品中蛋白质含氮量的倒 数) ) 。这种方法是K j e l d a h l 在 1 8 8 3年发明的， 当时他只使用硫酸分解试样， 测定谷物中的蛋白含量， 需要较长的反应时间。后来 G u n n i n g 搞清楚了消化机理， 在消化时加入 K s O 使反应温度由原来的3 8 0 ~ C( 硫酸沸点) 上升到4 0 0 ~ C， 并加入硫酸铜为催化剂， 提高了消化速度， 改进了凯氏定氮法。该方法的缺点是耗时长， 灵敏度低， 样品中的含氮化合物会影响蛋白含量的测定。要想准确测定出蛋白含量， 可以先测定出总含氮量。再用三氯乙酸将样品溶液中的蛋白沉淀除去， 然后测定溶液的非蛋白含氮量， 最后从总含氮量中扣除非蛋白含氮量就可以比较准确地测定出样品的真正蛋白含量。
10、双缩脲法 ( B i u r e t 法)
双缩脲( N H C O N H C O N H ) 是两分子的脲经 1 8 0 o C左右加热， 放出一分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中， 双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物， 称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键， 或间隔一个碳原子相连的肽键结构的化合物都可以发生双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比， 而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关， 可用来测 定蛋白质含量。测定范围为 1～1 0 mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有： 硫酸铵、 T r i s 缓冲 液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速， 不同的蛋白质产生颜色的深浅相近， 以及干扰物质 少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速、 但并不需要十分精确的蛋白质测定。
11、F o l i n - 酚试剂法( L o wr y法)
F o l i n ． 酚试剂法( L o w r y法) 是由L o w r y在双缩脲方法的基础上发展的。他在双缩脲试剂的基础上又增加了一种增强显色的试剂——磷钼酸和磷钨酸的混合液， 它们被蛋白质中酪氨酸残基的酚羟基还原， 产生深蓝色( 钼蓝和钨蓝的混合物) ， 以增加显色量， 从而提高了检测蛋白 质的灵敏度。该测定法的优点是灵敏度高， 比双缩脲法灵敏得多， 此法可检测的最低蛋白质量达5 1 x g 。通常测定范围是2 0— 2 5 0 p ． g 。缺点是费时较长， 要精确控制操作时间。因L ow r y 反应的显色随时间不断加深， 因此各项操作必须精确控制时间， 标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差， 干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子， 同样容易干扰 L ow r y反应， 而且对后者的影响更大。酚类、 柠檬酸、 硫酸铵、 T r i s 缓冲液、 甘氨酸、 糖类、 甘油等均有干扰作用。由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸， 显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度( 相对于标准蛋白质) 。
12、考马斯亮蓝法( B r a d f o r d法)
双缩脲法和 F o l i n 一 酚试剂法的明显缺点和使用限制， 促使科学家去寻找更好的蛋白质含量测定方法。1 9 7 6年， 由B r a d f o r d建立的考马斯亮蓝法( B r a d fo r d法) 是根据考马斯亮蓝G- 2 5 0染料在酸性溶液中与蛋白质中的碱性氨基酸( 特别是精氨酸) 及芳香族氨基酸残基相结合， 使染料最大吸收峰的位置( A ) 由4 6 5 n m变为 5 9 5 n m， 溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色的原理设计的l _ 4 j 。在 5 9 5 n m下测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法， 因而正在得到广泛的应用。
考马斯亮蓝法的突出优点是： ( 1 )灵敏度高， 比 L ow r y法约高 4倍， 最低蛋白质检测量可达 1 I x g 。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大， 蛋白质- 染料复合物有更高的消光系数。( 2 )测定快速、 简便， 只需加一种试剂。完成一个样品的测定一般只需要 5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程大约只要 2分钟即可完成 ， 其颜色可以在 1小时内保持稳定， 且在5分钟至2 0分钟之间， 颜色的稳定性最好。因而完全不用像 L ow r y 法那样费时和严格地控制时间。( 3 )干扰物质少。如干扰 L ow r y法的 K 、 N a 、 M g 、 r i f f s 缓冲液、 糖和蔗糖、甘油、 巯基乙醇、 E D T A等均不干扰此测定法。
此法的缺点是： ( I )由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同， 因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。( 2 )主要的干扰物质有： 去污剂、 T r i t o n X 一 1 0 0 、 十二烷基硫酸钠( S D S ) 和0 ． I mo l ／ L的N a O H。( 3 )标准曲线有轻微的非线性 ， 因而不能用 B e e r 定律进行计算， 而只能用标准曲线来测定。
13、紫外吸收法
蛋白质分子中的酪氨酸、 苯丙氨酸和色氨酸残基使其在 2 8 0 n m处具有紫外吸收， 其吸光度与蛋白质含量成正比。此外， 蛋白质溶液在 2 3 8 n m的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。
紫外吸收法简便、 灵敏、 快速， 不消耗样品， 测定后能回收。低浓度的盐和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差， 专一性差， 干扰物质多， 若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质， 会出现较大的干扰。虽可以校正， 但还是存在一定的误 差。在用标准曲线法测定蛋白质含量时， 对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大 的蛋白质， 有一定的误差。故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。此外，由于蛋白质吸收峰常因p H的改变而有变化， 因此测定样品时的 p H要与测定标
14、傅里叶近红外漫反射光谱
非破坏性分析， 能够提供完整籽粒黄豆样品成分的含量信 皂 结合 偏最小二乘回归法( P a r t i a l L e a s t — S q u a r e s ， P L S ) ，以 3 9个不同品种的完整籽粒黄豆样品建立蛋白质和脂肪含 近红外定量分析模型， 其中蛋白质、 脂肪含量分析模型的测定系数 尺 分别为 9 9 ． 3 0 ， 9 7 ． 5 2 ．相对标准偏差 R S D分别为0． 7 6 ％和 1 ． 3 ％， 检验集的化学值与模型预测值的相关系数 r分别为0 ． 9 4 7 3 ， 0 ． 8 6 9 5 ：用所建模型对 2 6 4个不同品种的黄豆样品进行预测，并采用 R — e r r o r 指标来估计分析结果的误差，其中蛋白质和脂肪模型预测的最小相对误差分别为0． 0
15、杜马斯燃烧定氮法
早在 1 8 3 3年，J e a n B a p t i s t e Du ma s 就开发出燃烧定氮法，后人定名为杜马斯 ( Du ma s )法。该方法的发明比凯氏法还早5 0年，但是由于早期的杜马斯法只能检测几个毫克的样品，使它的实际应用受到了极大的限制 ，在随后的岁月里这种方法没有被广泛的应用开来。近十年来，随着可以检测克级样品的杜马斯法快速定氮仪问世，才拉开了其在食品、饲料、肥料、植物、土壤及临床等领域上广泛应用的序幕。目前，在西方国家的很多实验室都已用杜马斯法代替凯氏法检 测全氮。
16、柱前衍生高效液相色谱法对动物组织中胶原蛋白的测定
动物组织中的胶原蛋白经酸水解后生成包括羟脯氨酸在内的氨基酸混合物，用邻苯二 甲醛( O P A) 与其中的一级氨基酸衍生，再用9 一 芴基甲氧基羰酰氯( F MO C ) 与其中的羟脯氨酸衍生，用反相高效液相色谱法测定羟脯氨酸含量。羟脯氨酸是胶原蛋白的特异性氨基酸且含量稳定，因而可通过样品中羟脯氨酸的含量计算胶原蛋白含量。在 0 ． O 1 ～ 5 0 m g· L 范围内，羟脯氨酸的峰面积和质量浓度之间的相关系数为 0 ． 9 9 9 3 ，保留时间和峰面积的相对标准偏差分别为 0 ． 3 0 ％和 2 ． 9 ％ 。该法选用 F MO C与氨基酸衍生产物的特征波长检测，能够完全屏蔽一级氨基酸衍生物的干扰，可快速 、准确、高效地测定羟脯氨酸及胶原蛋白的含量。
17、色谱-串联质谱分析
通过埘提取大鼠脑组织总蛋白不同方法的研究， 建立提取脑组织总蛋白的标准方 法。方法 在本实验中分别用总蛋白提取试剂盒和 自制裂解液提取脑组织总蛋 白， 测量蛋白浓度。用体积排阻色谱( S E C) 分离后分别进行基质辅助激光电离飞行时间质谱( MA L D I — T O F — M S ) 做蛋白全谱。结果 总蛋白提取试剂盒和自制裂解液总蛋白提取量分别为： ( 5 ． 6± 0 ． 2 ) mg 、 ( 6 ． 7±0 ． 5 ) m g ， M A L D I — T O F — MS蛋白全谱的谱峰数分别为( 3 0 4． 2± 2 2 ． 3 ) 和( 3 3 1 ． 6± 3 0 ． 5 ) 个。结论 自制裂解液与 常规的总蛋白提取试剂盒相比具有蛋白提取率高、 蛋白溶解性好等优点。18、染料结合法测定蛋白质含量
(一)方法原理
在酸性条件下,样品蛋白质中的组氨酸、精氨酸和赖氨酸残基与偶氮磺酸染料如酸性橙(AO-12,一种单磺酸盐)发生静电结合,形成不溶性的复合物。加入过量的偶氮磺酸染料,反应按下式进行:
蛋白质+染料(过量)＝蛋白质 - 染料络合物+染料(多余)
蛋白质含量与染料结合量之间存在正相关关系,先对20个左右蛋白质含量不等的样品用凯氏法测得蛋白质百分含量, 再由染料结合法测定相应样品未结合的染料溶液透光率,对二者进行数理统计,求出回归方程。
(二)仪器、设备
1.仪器
GXD-201型蛋白质分析仪(或72型光电比色计)；离心机(4000转/分)；分析天平(感量0.0001克,或0.0001克)；振荡器；有塞试管；离心管；刻度吸管。
2.试剂
(1)磷酸缓冲液:3.4克磷酸二氢钾,20克草酸加蒸馏水溶解后,再加1.7毫升85%磷酸(H3PO4)60毫升冰醋酸,1毫升丙酸,稀释至1000毫升。
(2)酸性橙-12染料溶液:用磷酸盐缓冲液加热溶解酸性橙-12(acid orangl-12分子量为350.37),配制成3.89mmol/L浓度溶液。
(3)半饱和醋酸钠溶液:先配成饱和醋酸钠溶液,称取75克无水醋酸钠于100毫升蒸馏水中,加热溶解、冷却并静置过夜,过滤得醋酸钠饱和溶液,再以蒸馏水稀释一倍即为半饱和醋酸钠溶液。
(三) 测定步骤
1.回归方程式的求得选取蛋白质含量高低不等的样品,粉碎过40目筛,按凯氏定氮法测定蛋白质含量。再称取相应的样品,均为0.5000克,放入有塞试管中,加2毫升半饱和醋酸钠溶液及20毫升酸性橙-12染料溶液,盖上塞子,置于振荡器上,在室温下振荡1小时。反应液以4000r/min离心10分钟然后在蛋白分析仪上测定上清液(即剩余染料溶液)的透光率。或者将上清液再稀释50倍,在72型光电比色计上,于482nm下测定溶液的透光率(或光密度)。根据20个左右样品凯氏法测得的蛋白质百分含量及同一批样品染料结合法剩余染料溶液的透光率进行数理统计,算出回归方程。
2.样品中蛋白质含量测定 取粉碎过40目筛的样品0.5000克,按上述操作加半饱和醋酸钠溶液,染料溶液,振荡、离心,在同样的蛋白分析仪上测定剩余染料溶液透光率或将上清液稀释50倍后,在同一72型光电比色计上测定透光率(或光密度)。
(四)结果计算
将待测样品的透光率代入回归方种式中,即可算出样品中蛋白质含量。
我们现在就用自动凯式、近红外漫反射光谱、杜马斯燃烧3种方法测定蛋白质，比色法比较麻烦。
我的社区
签到
赛默飞实验室产品焕新计划有奖调研！
【七月征文】不一YOUNG实验“猿”
报名开启：ICS2024第十三届光谱网络会议！
推荐收藏！盘点中药材及饮片检测解决方案
