主题：【讨论】悬赏征集真蛋白的检测技术（已征集18种）

很强大滴检测方法征集撒，槽是见识了，不过莫有方法分享

染料结合法测定蛋白质含量

(一)方法原理
在酸性条件下,样品蛋白质中的组氨酸、精氨酸和赖氨酸残基与偶氮磺酸染料如酸性橙(AO-12,一种单磺酸盐)发生静电结合,形成不溶性的复合物。加入过量的偶氮磺酸染料,反应按下式进行:
蛋白质+染料(过量)＝蛋白质 - 染料络合物+染料(多余)
蛋白质含量与染料结合量之间存在正相关关系,先对20个左右蛋白质含量不等的样品用凯氏法测得蛋白质百分含量, 再由染料结合法测定相应样品未结合的染料溶液透光率,对二者进行数理统计,求出回归方程。
(二)仪器、设备
1.仪器
GXD-201型蛋白质分析仪(或72型光电比色计)；离心机(4000转/分)；分析天平(感量0.0001克,或0.0001克)；振荡器；有塞试管；离心管；刻度吸管。
2.试剂
(1)磷酸缓冲液:3.4克磷酸二氢钾,20克草酸加蒸馏水溶解后,再加1.7毫升85%磷酸(H3PO4)60毫升冰醋酸,1毫升丙酸,稀释至1000毫升。
(2)酸性橙-12染料溶液:用磷酸盐缓冲液加热溶解酸性橙-12(acid orangl-12分子量为350.37),配制成3.89mmol/L浓度溶液。
(3)半饱和醋酸钠溶液:先配成饱和醋酸钠溶液,称取75克无水醋酸钠于100毫升蒸馏水中,加热溶解、冷却并静置过夜,过滤得醋酸钠饱和溶液,再以蒸馏水稀释一倍即为半饱和醋酸钠溶液。
(三) 测定步骤
1.回归方程式的求得选取蛋白质含量高低不等的样品,粉碎过40目筛,按凯氏定氮法测定蛋白质含量。再称取相应的样品,均为0.5000克,放入有塞试管中,加2毫升半饱和醋酸钠溶液及20毫升酸性橙-12染料溶液,盖上塞子,置于振荡器上,在室温下振荡1小时。反应液以4000r/min离心10分钟然后在蛋白分析仪上测定上清液(即剩余染料溶液)的透光率。或者将上清液再稀释50倍,在72型光电比色计上,于482nm下测定溶液的透光率(或光密度)。根据20个左右样品凯氏法测得的蛋白质百分含量及同一批样品染料结合法剩余染料溶液的透光率进行数理统计,算出回归方程。
2.样品中蛋白质含量测定 取粉碎过40目筛的样品0.5000克,按上述操作加半饱和醋酸钠溶液,染料溶液,振荡、离心,在同样的蛋白分析仪上测定剩余染料溶液透光率或将上清液稀释50倍后,在同一72型光电比色计上测定透光率(或光密度)。
(四)结果计算
将待测样品的透光率代入回归方种式中,即可算出样品中蛋白质含量。

原文由 xujing0202520(xujing0202520) 发表:
染料结合法测定蛋白质含量

(一)方法原理
在酸性条件下,样品蛋白质中的组氨酸、精氨酸和赖氨酸残基与偶氮磺酸染料如酸性橙(AO-12,一种单磺酸盐)发生静电结合,形成不溶性的复合物。加入过量的偶氮磺酸染料,反应按下式进行:
蛋白质+染料(过量)＝蛋白质 - 染料络合物+染料(多余)
蛋白质含量与染料结合量之间存在正相关关系,先对20个左右蛋白质含量不等的样品用凯氏法测得蛋白质百分含量, 再由染料结合法测定相应样品未结合的染料溶液透光率,对二者进行数理统计,求出回归方程。
(二)仪器、设备
1.仪器
GXD-201型蛋白质分析仪(或72型光电比色计)；离心机(4000转/分)；分析天平(感量0.0001克,或0.0001克)；振荡器；有塞试管；离心管；刻度吸管。
2.试剂
(1)磷酸缓冲液:3.4克磷酸二氢钾,20克草酸加蒸馏水溶解后,再加1.7毫升85%磷酸(H3PO4)60毫升冰醋酸,1毫升丙酸,稀释至1000毫升。
(2)酸性橙-12染料溶液:用磷酸盐缓冲液加热溶解酸性橙-12(acid orangl-12分子量为350.37),配制成3.89mmol/L浓度溶液。
(3)半饱和醋酸钠溶液:先配成饱和醋酸钠溶液,称取75克无水醋酸钠于100毫升蒸馏水中,加热溶解、冷却并静置过夜,过滤得醋酸钠饱和溶液,再以蒸馏水稀释一倍即为半饱和醋酸钠溶液。
(三) 测定步骤
1.回归方程式的求得选取蛋白质含量高低不等的样品,粉碎过40目筛,按凯氏定氮法测定蛋白质含量。再称取相应的样品,均为0.5000克,放入有塞试管中,加2毫升半饱和醋酸钠溶液及20毫升酸性橙-12染料溶液,盖上塞子,置于振荡器上,在室温下振荡1小时。反应液以4000r/min离心10分钟然后在蛋白分析仪上测定上清液(即剩余染料溶液)的透光率。或者将上清液再稀释50倍,在72型光电比色计上,于482nm下测定溶液的透光率(或光密度)。根据20个左右样品凯氏法测得的蛋白质百分含量及同一批样品染料结合法剩余染料溶液的透光率进行数理统计,算出回归方程。
2.样品中蛋白质含量测定 取粉碎过40目筛的样品0.5000克,按上述操作加半饱和醋酸钠溶液,染料溶液,振荡、离心,在同样的蛋白分析仪上测定剩余染料溶液透光率或将上清液稀释50倍后,在同一72型光电比色计上测定透光率(或光密度)。
(四)结果计算
将待测样品的透光率代入回归方种式中,即可算出样品中蛋白质含量。

非常感谢您的补充。

其实历史上有很多人探索过蛋白检测,得出的结论是凯氏适应性最强,最容易推广,综合考虑是最优办法。所以人们为了让凯氮可以使用，花费了大量时间和精力，通过做实验得出了几乎所有样品种类的凯氏系数。

其实历史上有很多人探索过蛋白检测,得出的结论是凯氏适应性最强,最容易推广,综合考虑是最优办法。所以人们为了让凯氮可以使用，花费了大量时间和精力，通过做实验得出了几乎所有样品种类的凯氏系数。

AACC② Method 46-14B 这个标准是做面粉的呀,而且有点太简单了吧,有点不靠谱.难怪1999年就有的标准到现在都没几个人知道.
如果真是好技术,为什么十几年都推广不开?

电位滴定法：用甲醛固定蛋白质的氨基从而释放出游离的羧基，并用氢氧化钠标准溶液滴定，通过测定中蛋白质的游离氨基酸的含量可以计算蛋白质中的氮含量从而求得蛋白质含量。比如，测牛乳中的蛋白质，可有效排除三聚氰胺等非蛋白氮的干扰。

仪器：电位滴定仪

建议制作标准物质，用不同方法做比对试验。比较得出最经济、快速、准确的方法。

看到如此昂贵的产品价格，真是伤心，我们做的仪器是采用荧光指示剂与蛋白质反应，通过检测荧光强度检测蛋白质含量，排除了凯氏定氮法的缺陷，精度高且可靠，价格便宜，2万即可完成一台仪器，可是目前仪器没有人来购买和采用，真是悲哀，本人联系邮箱：joyui@sina.com

上来瞧一瞧，学习学习。。。