主题：【分享】原核表达的心得

最近2个月都在做原核表达，刚开始什么都不会，连SDS-PAGE都跑成模糊的一片，其中的辛酸只有自己知道，现在实验慢慢上正轨了，自己也积累了一些经验。很怀恋之前探索的那段时光，现在把我做蛋白表达的过程和一些问题写出来，希望能够帮助开始做蛋白表达的人少走一些弯路。

1、表达载体的构建

构建表达载体是比较简单的，不过也是需要对你的蛋白还有所用的载体有一个详细的认识，对于比较大的蛋白最好选用能够助溶的标签，但是也不是固定的，比如我的蛋白有65-70KD，我也用的也是HIS，上清也是有少量表达。最关键的我觉得是ORF框不要发生移码突变，比较保险的做法可以先做电子克隆预测，推荐accelrys gene，功能很强大，非常好用。转化我是分两步走的，连接产物先转化DH5α再提质粒转化BL21，虽然比较繁琐但是比较保险，一般不会出现什么问题。构建载体没有出现什么大问题，所以也没有什么经验跟你们探讨，我从引物合成到测序完成，边做边玩2周搞定。

2、原核表达

原核表达遇到的问题就很多了，先贴张最开始跑的图（我都不好意思拿出来），所以说开始实验做得不好没有关系，没有人天生就会，都要靠后天慢慢学习。

现在开始正题，开始，图方便，晚上接菌(接的很少，5μl接到10ml中)，第二天加1mM IPTG 37 °诱导3小时，SDS-PAGE图如下：（3#和5#菌是我两个测序正确的单菌落，I是有加IPTG诱导）

实验组和对照组蛋白表达没有差异。

后来拿过夜的菌液去测OD，呵呵，2点多，果断重新接菌，我一般按照1:100（园子的以前的大神说的）取过夜的菌液加到新的LB-KANA培养基，一般摇个3小时，OD=0.8，再去跑SDS-PAGE，图如下：（我的目的蛋白是65KD,红色的marker是70KD）

结果显然意见，信心十足往下做，这一次还是图方便，一般接菌时为了能快点让菌的OD达到0.8，我把转数提高到了220rpm，我比较懒，既然是已经调了220rpm了，诱导的时候也就索性还是220rpm，还是37°3h。这次我还顺便做了IPTG梯度，单位是mM，SDS-PAGE图如下：

结果很郁闷，之前虽然目的蛋白也是很少，但是至少还是和上面的条带差不多大，但是这次，小的可怜（红色箭头标出）0.2mM的IPTG还不足以诱导蛋白表达，但是IPTG的浓度对蛋白表达也没上面影响。

什么原因，什么原因呢，隐约记得上次蛋白量比较多好像是160rpm摇的，马上换转数，SDS-PAGE图如下：

蛋白大小又回到原来大小了，原来转数真的影响表达啊，没有加IPTG的菌体自身蛋白比较多，说明IPTG对菌体还是有影响的，IPTG的浓度真的没有多大关系，这次0.2mM的也诱导出来了。

蛋白怎么表达这么少呢，是不是诱导时间太少，我又做了6h诱导时间，结果目的蛋白没有多大变化，反而菌体蛋白增加了。那低温诱导过夜呢，试试看，我做了2个温度，16和25，均诱导过夜，160rpm，SDS-PAGE如下：

很开心，还是先验证是目的蛋白再往下做，本来想做质谱，偏偏实验室的质谱坏了，刚好在园里看到有我这个目的蛋白的鼠单抗，哈哈，老天对我真好，果断试用，WB图如下：

接下来看看蛋白在上清还是沉淀表达，我是按照分子克隆指南上面的做法，100ml菌液16度和25度（感觉上次16和25差不多，所以还是做2个温度）过夜诱导，加4ml的结合缓冲液后，加溶菌酶到终浓度为1mg/ml，4°摇床20min，加tritonX-100至终浓度为1%，4°摇床20min，5000g离心20min，沉淀和上清分别上样，图如下：

虽然上清只有一点，但是我已经很开心，今天时间比较晚，没有超声，明天超声后再去跑，感觉应该上清的目的蛋白会更多一点。等我图片出来马上跟大家分享哈。