主题：【原创】【新】奶粉中的维生素A、D3、E测定——SPE-HPLC皂化法

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发表于：2013/09/02 13:56:01 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

之前版友的帖子：【原创】奶粉维生素ADE，真是惭愧，我给大伙儿分享了“古老”的分析方法（见10楼）。有版友问：超生会不会对维生素ADE有损失？

刚问了我们的研发主管，得到的回复是：“超声是提取不出来的脂溶性维生素的. 我们的新方法还是用皂化提取的方法，没有明显改变国标的提取方法，只是在萃取的时候用SPE了。”

于是，我来开了这个楼，跟大伙儿接着聊奶粉中维生素测定的那些事儿……

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奶粉中的维生素A、D3、E的测定固相萃取-高效液相色谱法

目前对奶粉中脂溶性维生素A、D3、E测定的前处理方法多采用皂化方法去除脂肪[1-7]，皂化过程后使用大量的有机溶剂进行液液萃取以洗除杂质，操作步骤复杂，维生素D3样品还需经硅胶柱做进一步的净化才能进行检测，造成实验时间成本的增加，不利于大批量样品的检测。本文研究了利用固相萃取法作为奶粉样品的前处理方法，高效液相色谱法作为检测手段，实现同时测定奶粉中维生素A、D3、E的含量，该方法可简化奶粉样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。

1. 样品处理

皂化提取：2g奶粉加入1mL水混匀，加入1 mL VC/乙醇溶液破壁处理，混匀，加入10mL氢氧化钾碱液（1.25g/mL），55℃条件下，水浴皂化45min，取出冷却至室温，向皂化液中加入适量无水乙醇，使之含50%乙醇，6000r/min离心5min后，取上清液，用1至2个微孔过滤器对其进行过滤，至Qdaura 卓睿™全自动固相萃取仪上样管中作为待净化液。

2. 固相萃取净化

Qdaura^TM卓睿全自动固相萃取仪程序设定：5mL甲醇，和5mL水活化，加样，10mL50%乙醇/水淋洗，抽干20min。2mL 丙酮，10mL乙酸乙酯洗脱，收集。收集液于40℃氮气吹干，1mL甲醇定容，0.45um PTFE过滤器过滤，准备进液相色谱分析。

3. 色谱条件

高效液相色谱仪：LC-10F

色谱柱：Venusil MP C18，4.6 mm *150 mm，5µm；

流动相：甲醇；

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

进样量：20µL；

波长变化见表1：

4. 结果与讨论

从左至右依次为：维生素A（5.0µg/mL）、维生素D3（9.8µg/mL）、维生素E（99µg/mL）

4.1 工作曲线及检出限

根据仪器对各个物质的响应情况，将维生素A、D3、E分别由储备液用正己烷逐级稀释，各稀释成7个浓度，维生素A浓度范围为0.25µg/mL~25µg/mL，维生素D3浓度范围为0.30µg/mL~30µg/mL，维生素E浓度范围为2.5µg/mL~250µg/mL，将溶液进HPLC进行检测，计算出检出限，回归方程及检出限见表2。可见，液相色谱仪对维生素A、D3、E的响应与浓度呈良好的线性关系。

4.2 皂化-固相萃取和传统皂化-液液萃取法的实验效果对比

传统皂化-液液萃取法参考《GB 5413.9—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E 的测定》的样品前处理2个奶粉（每个样称取2g）的平行样，作为参照。同时以皂化固相萃取法做两个平行样品。

由于选用的奶粉VD含量较低，没有检出。

从上述对比可以看出，皂化固相萃取法相比国标的皂化液液萃取法具有简单高效的优势，同时萃取效果更好。唯一的缺点是出峰靠前的维生素A附近有较多的弱保留物质的干扰，但是依靠MP C18的强大的分离能力，可以实现分离维生素A和干扰物质的基线分离。同时这些弱保留的物质很容易被洗脱出色谱柱，所以不会对色谱柱造成较大的污染。

4.2.3加标回收率实验