今天又遇到一个问题:我做真核表达连的是pEGFP-c1真核载体,目的基因插在绿色荧光蛋白的后面,选的酶切位点是xholI 和BamHI 。为了酶切方便,我在上游引物的酶切位点后加入了一个“G”(引物序列:依次为:两个保护碱基--酶切位点---辅助酶切的碱基“G”---kozak序列-----目的基因序列: CC CTCGAG G gcCACC ATGAAATACACAAgc)。今天猛然想起可能有移码的可能,蛋白可能会不表达,或表达错误,所以重新看了看载体。发现从了绿色荧光蛋白的起始密码子(613-615)开始到xholI(算上xholI的6个碱基)之间共有736个碱基,加上一个“G”及kozak序列,则绿色荧光蛋白起始密码子到目的基因的起始密码子之间有743个碱基,不是3的倍数,会造成移码的。 可是,后来我又算了一下,如果引物序列只有酶切位点和目的基因组成,没有多出来的一个“G”和kozak序列的话,绿色荧光蛋白起始密码子到目的基因的起始密码子之间有736个碱基,也不是3的倍数。所以现在很迷茫,在考虑要不要重新设计引物了。 请大家务必要帮帮忙啊!实验室也没有可以咨询的人,导师对这个也不是很懂,只有求助于大家了! |