液相色谱两大核心条件--流动相与色谱柱
色谱柱和流动相(也就是我们常说的固定相)在液相色谱中起着非常关键的作用,是色谱和液相色谱的代表。色谱柱是色谱的代表,起着样品分离的作用,是色谱产品的核心部件,就像人的心脏;流动相是液相色谱的代表,是液相色谱的灵魂,起着运输样品和样品洗脱的作用,就像人体中的血液。
液相色谱柱和流动相在液相色谱中的作用是不言而喻的,选择合适的流动相和液相色谱柱是高效液相色谱法成败的关键。
色谱柱和流动相选择合适,对实验结果带来的不仅是效果良好,像缩短检测时间,提高分离度,提高灵敏度,减少实验费用等方面都可能会带来正面影响。
下面就以检测三聚氰胺和维生素B1为例介绍下。
三聚氰胺检测
色谱条件
检测器:紫外检测器
色谱柱:C18色谱柱,250mm X 4.6mm,5um
离子对试剂缓冲液:准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠,加入约980ml水溶解,调节PH值至3.0后,定容至1L,备用
流动相:离子对试剂缓冲液:乙腈=90:10(V:V)
波长:240nm
流速:1.0ml/min
柱温:40℃
进样量:20uL
C18 250mm色谱柱,离子对试剂缓冲液:乙腈=90:10(V:V)色谱图
C18 150mm色谱柱,离子对试剂缓冲液:乙腈=90:10(V:V)色谱图
C8 250mm色谱柱,离子对试剂缓冲液:乙腈=90:10(V:V)色谱图
C8 150mm色谱柱,离子对试剂缓冲液:乙腈=90:10(V:V)色谱图
检测器:紫外检测器
色谱柱:Pgrandsil-SCX,250mm X 4.6mm,5μm
流动相:0.05mol/L磷酸二氢钾溶液:乙腈=70:30(V:V)
检测波长:240nm
流速:1.5mL/min
柱温:室温
进样量:20uL
250mm色谱柱0.05mol/L磷酸二氢钾溶液:乙腈=70:30(V:V)色谱图
150mm色谱柱0.05mol/L磷酸二氢钾溶液:乙腈=70:30(V:V)色谱图
250mm色谱柱0.05mol/L磷酸二氢钾溶液:乙腈=80:20(V:V)色谱图
150mm色谱柱0.05mol/L磷酸二氢钾溶液:乙腈=80:20(V:V)色谱图
维生素B1检测
色谱条件
检测器:紫外检测器
色谱柱:Pgrandsil STC C18 250mm X 4.6mm,5um
波长:267nm
流动相:在已经装入700ml去离子水的1000ml容量瓶中,加入50mg乙二胺四乙酸二钠,1.1g庚烷磺酸钠,待全部溶解后,加入25ml乙酸5ml三乙胺,用去离子水定容至刻度,摇匀。用乙酸或三乙胺调节该溶液的pH值为3.4,滤膜过滤后,取该溶液860ml与140ml甲醇混合,脫气
流速:1.0ml/min
柱温:室温
进样量:10ul
色谱图:
检测器:紫外检测器
色谱柱:PgrandsilSTC C18 250mm X 4.6mm,5um
流动相:20mM磷酸二氢钠溶液(pH=7.0):甲醇=80:20(V:V)
波长:267nm
流速:1.0mL/min
柱温:室温
进样量:10ul
色谱图:
概括
1.流动相不同,色谱背景信号值不同,保留时间不同,方法灵敏度也会不一样。
2.色谱柱不同(规格不同)样品出峰时间不同,样品的峰高和峰面积也不同,方法的灵敏度也不一样。
3.在反相色谱中增加有机相的含量,样品保留时间缩短,峰高变高,灵敏度提高,分离度降低。
4.流动相和色谱柱是相互作用的,改变其中一相都有可能会对灵敏度、保留时间、分离度等重要指标起到正向作用。
5.以有机相加缓冲液为流动相比有机相加水为流动相实验效果好(大多指标),包括保留时间、杂质干扰、灵敏度等指标。但这种流动相对色谱柱的破坏程度也相对较大,使用时要综合考虑,选择最佳方案。
6.流动相和色谱柱对实验非常重要,但实验效果并不是完全由这两个条件决定的,有时通过改变其它色谱条件同样能得到理想的结果。
注意:
1.以上实验过程有时间的差异(不是同一时间做的),有环境的差异,有样品的差异等,所以谱图只是参考,不能完全真实的反应实验对比情况。
2.改变色谱条件要立足实验室的当前情况和实验的具体要求,切不可盲目去行事,这样可能会费时、费力,甚至影响实验效果,损坏实验仪器。如果做科研项目,找到最佳的色谱条件那自然是最好的。
总结
1.流动相和色谱柱是液相色谱实验的两大关键条件,尽量做到最佳。
2.实验方案要立足于现状。
3.同时改变多个色谱条件,效果往往会更好。