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主题：【求助】色谱峰出现分叉如何解释？（样品中含有缓冲盐）

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shanshunan
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发表于：2014/03/25 21:49:13 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
流动相为水和甲醇的固定比例的混合液，之前进样一直正常。

今天用缓冲液调整了样品的pH值（从4调至6），进样后发现了主峰左侧出现了分叉（约3min）而且出峰提前了一点，如图，请教各位高手是什么原因？

PS：已确认色谱柱没有问题。

该帖子作者被版主 三人行加 2积分， 2经验，加分理由：鼓励
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2014/3/25 21:59:34 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
主峰的保留时间太靠前，可能主成分峰和杂质峰无法完全分离，建议将主峰保留时间调至10分钟左右再看色谱图。
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2014/3/25 22:00:58 Last edit by jncxyy2012
jingma1239
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2014/3/25 23:55:05 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主用的检测波长？缓冲盐？保留时间这么靠前很有可能是缓冲盐的峰
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zhaohua8011
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2014/3/26 9:10:25 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
样品在次ph下不稳定分解了？
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doczheng
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2014/3/26 9:29:52 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
三分钟就出峰，这样不好吧，至少要控制一下保留时间
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zhoujin83
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2014/3/26 12:08:49 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
检查一下样品性质吧。楼主的样品估计是弱酸性，而且其pKa应该为6左右。所以之前楼主的稀释剂pH=4，样品完全不电离，同时流动相因为没有缓冲盐，所以pH变化不大，样品进入流动相后仍然呈分子状态，就能得到一个很好的峰；而将稀释剂pH调到6后，样品在这个pH下有两种状态，即分子态和离子态，并将这种状态保持到流动相中，所以出现了这样的峰形。另外，由于楼主的样品是弱酸性的，其保留随流动相pH的变化情况是，流动相pH增大，保留减小，流动相pH减小，保留增大。如上所述，楼主的流动相没有缓冲能力，稀释剂pH增大后，流动相pH也相应增大，所以样品保留减小了。
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2014/3/26 12:11:18 Last edit by zhoujin83
shanshunan
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2014/3/26 22:00:27 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 zhoujin83(zhoujin83) 发表:

检查一下样品性质吧。楼主的样品估计是弱酸性，而且其pKa应该为6左右。所以之前楼主的稀释剂pH=4，样品完全不电离，同时流动相因为没有缓冲盐，所以pH变化不大，样品进入流动相后仍然呈分子状态，就能得到一个很好的峰；而将稀释剂pH调到6后，样品在这个pH下有两种状态，即分子态和离子态，并将这种状态保持到流动相中，所以出现了这样的峰形。另外，由于楼主的样品是弱酸性的，其保留随流动相pH的变化情况是，流动相pH增大，保留减小，流动相pH减小，保留增大。如上所述，楼主的流动相没有缓冲能力，稀释剂pH增大后，流动相pH也相应增大，所以样品保留减小了。


谢谢的zhoujin83分析，样品性质确实如你所述，低pH值为分子态，升高pH值会逐渐向离子态变化。

再继续请教，我在升高pH值该如何进行HPLC方法条件的设置使之只出一个峰？或者在计算这种物质的峰面积时我能够把两个峰面积值加一下？谢谢！
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shanshunan
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2014/3/26 22:01:21 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 jingma1239(jingma1239) 发表:

楼主用的检测波长？缓冲盐？保留时间这么靠前很有可能是缓冲盐的峰


280nm、磷酸盐缓冲液
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shanshunan
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2014/3/26 22:02:17 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 zhaohua8011(zhaohua8011) 发表:

样品在次ph下不稳定分解了？


样品在pH升高时会又分子态向离子态过渡
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shanshunan
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2014/3/26 22:04:06 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 三人行(jncxyy2012) 发表:

主峰的保留时间太靠前，可能主成分峰和杂质峰无法完全分离，建议将主峰保留时间调至10分钟左右再看色谱图。


样品纯度较高，所以就提前出峰了，不知这样做是否妥当？
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三人行
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2014/3/26 22:13:43 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 shanshunan(shanshunan) 发表:
原文由 三人行(jncxyy2012) 发表:

主峰的保留时间太靠前，可能主成分峰和杂质峰无法完全分离，建议将主峰保留时间调至10分钟左右再看色谱图。


样品纯度较高，所以就提前出峰了，不知这样做是否妥当？


这可不好说，可用二极管阵列检测器看峰纯度。
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