主题：【已应助】HPLC分析叶酸精密度和线性都比较差。

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顶上来继续讨论！

发现是和具体仪器有关，但没找到根本原因。

waters600自动进样和安捷伦1260自动进样都不正常，表现为不同标准曲线的峰面积不成线性。

但岛津LC20AD手工进样正常，请指点。

个人认为，您这个结论值得怀疑。如果是某一台仪器自动进样器不正常尚可理解，但是两台都不正常我认为不应该。一般来说，自动进样器比手动进样更精密。

其实我说的和仪器有关，严格说，不是是结论，只是一种现象。我还在观察中。

如果最后确定是和仪器有关，那显然不是什么进样器之间的精密度差别，而是更深层的原因。三台仪器的进样器做其它的样品时是正常的，RSD肯定小于1% 。

我说它不成线性，是类似这样的数据，浓度1，峰面积20，浓度2，峰面积31，浓度3，峰面积45。

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发现是和具体仪器有关，但没找到根本原因。

waters600自动进样和安捷伦1260自动进样都不正常，表现为不同标准曲线的峰面积不成线性。

但岛津LC20AD手工进样正常，请指点。

个人认为，您这个结论值得怀疑。如果是某一台仪器自动进样器不正常尚可理解，但是两台都不正常我认为不应该。一般来说，自动进样器比手动进样更精密。

其实我说的和仪器有关，严格说，不是是结论，只是一种现象。我还在观察中。

如果最后确定是和仪器有关，那显然不是什么进样器之间的精密度差别，而是更深层的原因。三台仪器的进样器做其它的样品时是正常的，RSD肯定小于1% 。

我说它不成线性，是类似这样的数据，浓度1，峰面积20，浓度2，峰面积31，浓度3，峰面积45。

我还是觉得方法问题可能性大点。

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百度了下叶酸。
葉酸
維基百科

葉酸

IUPAC名
N-[4(2-Amino-4-hydroxy
pteridin-6-ylmethylamino)
benzoyl]-L(+)-glutamic acid.
別名        pteroyl-L-glutamic acid; Vitamin B9, Vitamin M; Folacin, Folic acid
識別
CAS號        59-30-3
SMILES       
C1=CC(=CC=C1C(=O)NC
(CCC(=O)O)C(=O)O)
NCC2=CN=C3C(=N2)
C(=O)N=C(N3)N
RTECS        LP5425000
性質
化學式        C19H19N7O6
摩爾質量        441.403 g·mol−1
外觀        橙黃色結晶
熔點        250 °C (523 K) 分解
溶解度（水）        8.5 g/100 ml (20 °C)
pKa        1st: 2.3, 2nd: 8.3
若非註明，所有數據來自25 °C，100 kPa。
叶酸的pKa第一点为2.3，所以你使用pH1.8的流动相是不合适的，建议使用pH4.0-4.5的流动相。

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抱歉，我记错了。

流动相是磷酸盐缓冲液，还有离子对试剂及三乙胺，水相PH2.4，水相:甲醇=30:70。我印象中加了有机相后PH还会变高的？不知道可不可以算出来加后是多少。一般的酸度计电极（我们是梅特勒的）可以用来测含有机相的流动相么。

请问如何根据叶酸的pKa第一点为2.3算出pH4.0-4.5的流动相是适用的？能教我一下相关的理论么。

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百度了下叶酸。
葉酸
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葉酸

IUPAC名
N-[4(2-Amino-4-hydroxy
pteridin-6-ylmethylamino)
benzoyl]-L(+)-glutamic acid.
別名        pteroyl-L-glutamic acid; Vitamin B9, Vitamin M; Folacin, Folic acid
識別
CAS號        59-30-3
SMILES       
C1=CC(=CC=C1C(=O)NC
(CCC(=O)O)C(=O)O)
NCC2=CN=C3C(=N2)
C(=O)N=C(N3)N
RTECS        LP5425000
性質
化學式        C19H19N7O6
摩爾質量        441.403 g·mol−1
外觀        橙黃色結晶
熔點        250 °C (523 K) 分解
溶解度（水）        8.5 g/100 ml (20 °C)
pKa        1st: 2.3, 2nd: 8.3
若非註明，所有數據來自25 °C，100 kPa。
叶酸的pKa第一点为2.3，所以你使用pH1.8的流动相是不合适的，建议使用pH4.0-4.5的流动相。