主题：【原创】ATP生物发光法快速评价医疗现场卫生状况

一．    医疗现场卫生的重要性及国家标准

医院是病人集中的场所，由于医院收住着患有各种疾病的病人，可直接或间接地污染医院环境。医院的空气、地面、用具、门、窗把手、水槽、水龙头、医疗器械等皆可被病原微生物污染，甚至成为医院内感染微生物的储菌所。

近年来，越来越多的医院已经认识到，污染的环境表面在传播病原微生物上发挥了重要的作用。Goodman（2008）指出，“病原体污染环境，通常发生在日常的医疗过程中。许多研究已经描述了通过接触污染的房间表面传播病原体。”  Eckstein（2007）指出，“感染或定植医疗相关病原体的病人，往往这些生物从他们的皮肤上脱落，并播散在环境中。尽管与病人直接接触一般被认为是医护人员的手获得病菌并随后传播给其他病人的主要来源，然而最近有几项研究表明，受污染的环境表面也发挥着传播病原体的重要作用。”

自2003年CDC建议，医院要确保有适当的环境卫生措施，以减少由于环境污染所导致的病原微生物的传播。

因此我国于1995年出台了医院消毒卫生标准GB15982-1995，规定了各类从事医疗活动的环境空气、物体表面、医护人员手、医疗用品。消毒剂、污水、污物处理卫生标准。

                                                                    如表1：

环境类别	范围	标准
		空气 cfu/m3	物体表面 cfu/cm2	医护人员手 cfu/cm2
Ⅰ类	层流洁净手术室、层流洁净病房	≤10	≤5	≤5
Ⅱ类	普通病房、产房、婴儿室、早产儿室、普通保护性隔离室、供应室无菌室、烧伤病房、重症监护病房	≤200	≤5	≤5
Ⅲ类	儿科病房、妇产科检查室、注射室、换药室、治疗室、供应室清洁室、急诊室、化验室、各类普通病房和房间	≤500	≤10	≤10
Ⅳ类	传染病科及病房	-	≤15	≤15

表1各类环境空气、物体表面、医护人员手细菌菌落总数卫生标准

医疗用品卫生标准：

1 进入人体无菌组织、器官或接触破损皮肤、粘膜的医疗用品必须无菌。

2  接触粘膜的医疗用品

细菌菌落总数应≤20cfu/g或100cm²；致病性微生物不得检出。

3  接触皮肤的医疗用品

细菌菌落总数应≤200cfu/g或100cm²；致病性微生物不得检出。

使用中消毒剂与无曲器械保存液卫生标准

1  使用中消毒剂

细菌菌落总数应≤100cfu/ML；致病性微生物不得检出。

2  无菌器械保存液

必须无菌。

国家规定了对于物体表面，医疗用品表面以及医护人员手采样的标准步骤，如下所示：

1.物体表面采样及检查方法

1.1  采样时间

选择消毒处理后4h内进行采样。

1.2  采样面积

被采表面<100cm²，取全部表面；被采表面≥100cm^2,取100cm²。

1.3采样方法

用5×5cm²的标准灭菌规格板；放在被检物体表面，用浸有无菌生理盐水平样液的棉拭子1支，在规格权内横竖往返各涂抹5次；并随之转动棉拭于。连续采样1-4个规格板面积；剪去手接触部分，将棉拭于放入装10ml采样液的试管中送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体的方法采样。

1.4  细菌菌落总数检查

可参照GB15982-1995

1.5  结果计算

物体表面细菌菌落总数（cfu/cm²）=平皿上菌落的平均数×采样液稀释倍数/采样面积(cm²)

2.医护人员手采样及检查方法

2．1  采样时间

在接触病人、从事医疗活动前进行采样。

2. 2  采样面积及方法

被检人五指并拢，将浸有无菌生理盐水采样液的棉试子一支在双手指曲面从指根到指端来回涂擦各两次（一只手涂擦面积30cm2〕，并随之转动采样棉试子，剪去手接触部位；将棉拭子放入装有10ml采样液的试管内这位。采样面积按平方厘米（cm²）计算。

2.  3  细菌菌落总数检查

可参照GB15982-1995

2.4结果计算

手细菌菌落总数（cfu/cm²）=平皿上菌落的平均数×采样液稀释倍数/30cm²

3  医疗用品采样及检查方法

3.1 采样时间

在消毒或灭菌处理后，存放有效期内采样。

3.2  采样量及采样方法

可用破坏性方法取样的医疗用品，如输液（血）器、注射器和注射计等均参照《中华人民共和国药典》1990年版一部附录中《无菌检查法》规定执行。对不能用破坏性方法取样的特殊医疗用品，可用浸有无菌生理盐水采样液的棉试子在被检物体表面涂抹采样，被采表面<100cm2，取全部表面；被采表面≥100cm2,取100cm2。

3.3无菌检查

按《中华人民共和国药典》1990年版一部附录中《无菌检查法》规定执行。

3.4  细菌菌落总数检查

可参照GB15982-1995

3.5  结果计算

医疗用品细菌菌落总数（cfu/cm²）=平皿上菌落的平均数×采样液稀释倍数/采样面积（cm²）

二．    ATP生物发光法与传统平板培养法的关系

ATP生物发光法是基于萤火虫发光原理，利用荧光素酶-荧光素体系，检测三磷酸腺苷(ATP)数量的一种快速有效的方法。ATP生物发光法的原理是虫荧光素酶(luciferase)在镁离子存在下，催化虫荧光素(luciferin)和ATP形成中间物后氧化成氧化型的荧光素，产生AMP，并将化学能转化成光能，释放出光子，反应表示如下：

Luciferin  +ATP+O2        Oxy-Luciferin+AMP+PPi+H2O+hv

在一定的ATP浓度范围内，此反应所释放出的光强度与体系中存在的ATP数量成良好的线性关系，如图1。因为三磷酸腺苷(ATP)存在于所有的活体细胞中，并且各生长期的细菌都还含有较恒定的ATP  量，因此这可以作为一种活体细胞的指示剂，通过ATP生物发光法检测出ATP数量，并由此推算出体系中细菌的数量，如图2。

图2.ATP生物发光强度与ATP数量的关系

图3.ATP生物发光强度与细菌数量的关系

基于上述检测依据，ATP快速检测技术也可用于判定医疗现场的卫生状况以及评估清洁消毒措施的有效性。

图拉扬科技独家代理 BLW1307ATP微生物检测系统检测方法如下：
由于不同用户所检测的目标不同，并且对于不同的待测物，其合格标准也有所不同，因此用户在使用前，需对自己所要检测的对象制定相应的合格标准，以确保检测结果的准确性。

方法如下：   

1.    准备一定浓度的菌悬液，分成两份，标明菌悬液A和菌悬液B

2.    将菌悬液A做梯度稀释，用传统的平板培养法培养24-48h，得到菌落总数，具体方法可以参照GB15982-1995。

3.    菌悬液B做同样的梯度稀释后，取10ul菌悬液至采样棒，检测其发光值。

注意：检测时请确保两种方法所得到的结果是来自于相同稀释度和相同体积的菌悬液，方可得到准确的细菌数与发光值RLU的对应关系。如图3所示

图4. 检测细菌数与发光值的关系

根据图4可得到回归方程，表明细菌数量与发光值RLU之间的线性关系，根据不同待测表面的微生物合格标准，可推算出相应的发光值。同时结合实际检测经验，制定和完善检测标准。

当使用表面洁净度检测试剂盒对物体表面、医护人员手、医疗用品进行检测时，取样方法可参照国标GB15982-1995，取样后与荧光酶体系反应，15s  即可得到结果，与制定的卫生监测标准比对后即可评估卫生状况。

ATP生物发光技术以其快速，简便和高灵敏度的特点迅速发展，在医药行业，卫生监督系统和食品行业内被广泛应用，但由于其固有的局限性，还不能完全取代传统的平板培养法，这两种方法相辅相成，互相补充，在微生物检测的实际应用中，发挥着各自的优势。