主题：【第七届原创】霍乱弧菌实时PCR快速检测方法的建立

1 材料和方法
1.1        菌株  12种细菌共100株细菌。包括1株沙门氏菌、1株志贺氏菌、1株大肠杆菌、1株金黄色葡萄球菌、1株蜡样芽胞杆菌、1株李斯特氏菌、1株溶藻弧菌、1株河弧菌、1株创伤弧菌、1株变形杆菌、40株副溶血弧菌和50株霍乱弧菌。霍乱弧菌的分离鉴定和肠毒素实验按照《霍乱防治手册》操作。其他11种细菌的分离和鉴定均按照中华人民共和国颁布的《食品微生物学》国家检验标准操作。
1.2        菌样模板提取  （1）DNA提取：菌株经LB增菌培养过夜后，菌体用500ul TE buffer 悬浮，加入终浓度为50ug/ul溶菌酶，37℃作用1小时，然后再加入终浓度为1% SDS 和0.2ug/ul的蛋白酶K，55℃作用1小时后，用酚-氯仿抽提DNA。（2）取1ml菌液，离心沉淀，制备菌悬液，煮液，取上清液5ul即可用于实时PCR反映。
1.3        样品模板DNA提取 （1）大便、呕吐物标本：用生理盐水悬浮，煮沸，10000rpm离心2min，取5ul上清液即可用于实时PCR反映。（2）食品样品：用碱性蛋白胨水增菌6-8小时后，取1ml菌液富集，煮沸，再取5ul上清液即可用于实时PCR反映。上述方法不需酚-氯仿抽提，快速简便有效，适于大批样品的模板提取。
1.4        霍乱弧菌检测体系的建立
1.4.1        引物和探针设计  根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因（xtxA）的序列并比较分析，自行设计一对引物和探针，扩增片段为80bp。引物和探针均由AB（applied biosystems）公司合成。
1.4.2        PCR反应条件  反应总体积为25ul，内含5ul模板，2.5ul 10×PCR缓冲液，1.5mmolMgCl2，0.25mmol/L dNTP,1UTaq酶，25pmol引物，25pmol探针。实时PCR反应参数为：94℃预变性5min，40个循环中94℃变性45S,62℃退火1min，72℃延伸1min。采用ABI7500实时PCR扩增仪退火阶段检测荧光。
1.4.3        特异性检测  以沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、蜡样芽胞杆菌、李斯特氏菌、溶藻弧菌、河弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌的DNA作对照，对霍乱弧菌进行ctxA实时PCR扩增。
1.4.4        灵敏度分析 选一株小川型霍乱弧菌（编号为 V32）作为灵敏度分析的代表株。包括DNA灵敏度分析和菌液灵敏度分析。DNA灵敏度分析按常规DNA方法提取模板DNA。用eppendorf  biophotometer核酸蛋白测定仪测DNA浓度，然后进行5倍稀释，每个稀释度取1ul用于实时PCR反应，菌液灵敏度分析为V32菌株经碱性蛋白胨水（APW）增菌过夜后，进行10倍稀释，工作10个稀释度，然后依次取10个稀释度的1ml菌液进行实时PCR反应。同时相对应的按中华人民共和国颁布的《食品微生物检验标准》做细菌总数计数。[2]

1                      结果

2.1特异性分析  12种细菌经实时PCR检测，只有霍乱弧菌肠毒素试验阳性的霍乱弧菌有荧光信号，其他细菌无荧光信号。见表1

表1霍乱弧菌实时PCR特异性分析

细菌	试验用菌株	肠毒素	实时PCR阳性数
大肠杆菌	1	－	０
蜡样芽胞杆菌	1	－	０
单增李斯特氏菌	1	－	０
志贺氏菌	1	－	０
沙门氏菌	1	－	０
金黄色葡萄球菌	1	－	０
变形杆菌	1	－	０
河弧菌	1	－	０
创伤弧菌	1	－	０
溶藻弧菌	1	－	０
副溶血弧菌	40	－	０
霍乱弧菌	5	－	０
霍乱弧菌	45	＋	45

2.2灵敏度结果霍乱弧菌DNA灵敏度为102.4fg/ul，菌液灵敏度为3cfu/PCR反应体系，对原始样品而言，菌液灵敏度为32cfu/ml。见过见表2－3。

表2霍乱弧菌实时PCR检测体系DNA灵敏度

DNA	200ng	40ng	8ng	1.6ng	320pg	64 pg	12.8 pg	2.56 pg	512fg	102.4fg	20.48fg
循环数	15.1	18.2	20.4	21.6	24.3	26.1	28	30.9	34.5	36.2	阴性

表3霍乱弧菌实时PCR检测体系菌液灵敏度

Cfu/ml	3.2×108	3.2×107	3.2×106	3.2×105	3.2×104	3.2×103	3.2×102	32	3	0
Cfu/PCR reaction	3.2×107	3.2×106	3.2×105	3.2×104	3.2×103	3.2×102	32	3	0	0
循环数	9.7	16.9	18.5	22.6	27.2	31	33	37.4	阴性	阴性

3讨论

本文建立了实时PCR检测霍乱弧菌的方法。研究表明：（1）此方法灵敏度高，每毫克或每毫升样品含32个细菌，即可检出。（2）特异性强，与对照组11种细菌无交叉反应。（3）操作简单，结果观察直观明了，可一次检测96份标本（含阴、阳性对照）。（4）适用于霍乱弧菌的快速诊断和大量样品的检测。检测大便标本仅需2h检测时间，检测海产品标本仅需1天时间。在单一实时PCR研究的基础上，最终实现多重时PCR同时诊断10种食源性致病菌，满足常见食源性疾病的快速诊断的要求。

霍乱作为甲类传染病，一直受到各级政府的重视，腹泻病人和外环境的霍乱监测是霍乱防治的重点。外环境监测包括水和海产品检测。由于水和海产品中含大量弧菌，采用传统方法往往需花很多时间用于霍乱弧菌和其他弧菌的区别，耗时耗力，因此需采用简便快速的检测技术达到快速筛选的目的，荧光PCR技术以其灵敏、操作简单、不需后电泳的特点满足了快速检测的需要。而且编码霍乱肠毒素A亚单位的基因（ctxA）是O1群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌的一个最重要的毒力因子。

结论：实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强，可用于霍乱的快速诊断，为霍乱的分子流行病学调查提供新的检测手段。
参考文献：
[1].Blackstone GM,Nordstrom JL. Detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in oyster enrichements by real-time PCR[J].Journal of Microbiological Methods,2003,53:149－155
[2]Chen shu，Yee Arlene. The evaluation of a fluorogenic polymerase chain reaction assay for the detection of Salmonella species in food commodities[J].International Journal of food Microbiology,1997,35:239－250.