主题：【第七届原创】HPLC法测定当归四逆汤合煎液与单煎合并液中阿魏酸和芍药苷的含量

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发表于：2014/07/31 16:56:47 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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HPLC法测定当归四逆汤合煎液与单煎合并液中阿魏酸和芍药苷的含量

目的：建立测定中药复方当归四逆汤主要成分含量的方法，比较当归四逆汤合煎液与单煎合并液中阿魏酸和芍药苷的含量差异。

方法：采用HPLC分析，色谱柱为YWG—C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）。分析阿魏酸含量：流动相为水: 乙腈=83：17，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长230nm，进样量为20μl。分析芍药苷：流动相为0.01%(v/v)磷酸水溶液:乙腈=95:5，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长230nm，进样量20μl。

结果:阿魏酸和芍药苷分别在3.375μg·mL^-1～67.5μg·mL^-1，0.8065μg·mL^-1～25.8000μg·mL^-1范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系,相关系数（r）分别为0.9996和0.9995；HPLC测定当归四逆汤中阿魏酸和芍药苷的含量稳定可行，简便，可作为当归四逆汤的质量控制标准。当归四逆汤合煎可提高有效成分的溶出。

当归四逆汤来源《伤寒论》，由当归、桂枝、芍药、细辛、通草、大枣、炙甘草组成。主治血虚寒厥证，手足厥寒，或腰、股、腿、足、肩臂疼痛，口不渴，舌淡苔白，脉沉细或细而欲绝。阿魏酸为该方当归的有效成分，也是当归四逆汤的重要成分之一，具有明显扩张冠状动脉血管、增加冠脉流量、抑制ADP诱导的血小板凝聚，增强细胞吞噬功能的作用。芍药苷具有显著的镇痛、镇静、抗惊厥作用、扩张血管作用、保护脑缺血的作用解痉解热作用等也具抗菌、抗病毒和抗真菌作用。本文利用HPLC法，对当归四逆汤合煎液与单煎合并液中阿魏酸和芍药苷含量进行比较，从而从一个侧面探讨当归四逆汤配伍的科学性。

材料与方法

1仪器和试药

1.1仪器：高效液相色谱仪（安捷伦）；HS3120超声仪； SZ-97A自动三重蒸馏水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；分析天平（TG-328A，上海天平仪器厂）；CS66-2电热恒温干燥箱（长沙医疗器械厂）；高速离心机（XYJ-2，江苏医疗仪器厂）等。

1.2试药：当归、桂枝、芍药、细辛、通草、大枣、炙甘草购自药店，经鉴定符合2010版药典。经去离子水漂洗（洗去浮尘与污物），于干燥箱中60℃干燥，按复方规定比例称量各单味药混匀，粉碎，置干燥器中备用。阿魏酸和芍药苷对照品购自中国药品生物制品检定所。甲醇，乙腈，磷酸均为色谱纯，实验用水为三重蒸馏水

2试验方法

2.1色谱条件

色谱柱为YWG—C18柱（4.6mm×250mm，10μm），柱温为30℃，流速为1.0 mL·min^-1，测定波长为230nm。进样量为20μL。分析阿魏酸流动相为：水：乙腈=83：17，芍药苷：0.01%(v/v)磷酸水溶液:乙腈=95:5。

2.2溶液制备

2.2.1对照品储备溶液的制备

精密称取阿魏酸，芍药苷适量，前者加甲醇配成135.0μg/ml阿魏酸对照品储备溶液备用，后者加热水配成25.8μg/ml芍药苷对照品储备溶液备用。

2.2.2样品溶液制备

精密称取当归、桂枝、芍药、细辛、通草、大枣、炙甘草，以及复方药材粉末各3份，放在25ml比色管中，分别加入20mL蒸馏水，浸泡30min，沸水浴30min。静置分离，吸取上清液，在残渣中加入15mL水，沸水浴20min，静置取上清液，再次在残渣中各加入10mL 水，沸水浴15min ，静置提取上清液。合并三次提取液，定容至50mL容量瓶中，即得当归四逆汤合煎液样品及各单味药样品。精密量取配方量的当归、桂枝、芍药、细辛、通草、大枣、炙甘草于10mL量瓶中，即得单煎合并液样品。将合煎液与单煎合并液样品经微孔滤膜（0.45μm）过滤，取续滤液即得样品溶液。

2.2.3标准曲线的制备

用刻度吸管精密吸取0.10,0.25,0.50,1.0,2.0mL “2.1.1”项下的阿魏酸和芍药苷对照品储备溶液，分别置于4mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀。进样20μL，应用HPLC方法进行测定。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标准曲线。

3 方法学考察

3.1 精密度试验

取同一阿魏酸和芍药苷对照品溶液各20μL，分别连续进样6次，计算阿魏酸，芍药苷峰面积RSD。

3.2 稳定性试验

取同一当归四逆汤合煎液样品溶液，分别于0，2，4，6，8，12测定，计算阿魏酸，芍药苷峰面积RSD。

3.3 重复性试验

按“2.2.2”项下方法制备3份合煎液样品溶液分别按测定条件进样，计算阿魏酸，芍药苷峰面积RSD。

3.4 回收率实验

精密吸取复方2^#样品溶液1mL，加入2^#阿魏酸对照品溶液1.4mL，进样20μL，依法测定计算阿魏酸回收率。精密吸取复方3^#样品溶液1mL，加入1^#芍药苷对照品溶液0.15mL，进样20μL，依法测定计算芍药苷回收率。

4 样品含量测定

取“2.2.2”项下制备的样品溶液，按3项下条件进行测定，根据2个成分的线性回归方程，对当归四逆汤合煎液与单煎合并液中的成分含量进行计算。

结果

1.HPLC色谱图见图1-6。阿魏酸，芍药苷标准曲线见图7，图8。阿魏酸标准曲线方程为A=29.581C-0.5973（C:μg •mL^-1）, r=0.9996。芍药苷标准曲线方程为A=28.663C-12.297（C:μg •mL^-1）, r=0.9995。

2.当归四逆汤中阿魏酸和芍药苷精密度测定结果见表1，表2。从表1可知，实验结果峰面积平均值为640.8 mv.s， RSD为4.3%，表明实验精密度良好；从表2可知，实验结果平均值为743.0mv.s， RSD为1.5%，表明实验精密度良好。

3. 当归四逆汤中阿魏酸和芍药苷稳定性测定结果峰面积RSD分别为 7.0%，3.1%，表明实验稳定性良好。

4. 当归四逆汤中阿魏酸和芍药苷重复性试验测定结果见表3，表4。从表3可知，实验结果阿魏酸峰面积平均值为195.5mv.s， RSD为2.4%，表明实验重复性较好；从表4可知，实验结果芍药苷峰面积平均值为99.9 mv.s，RSD为3.0%，表明实验重复性较好。

5. 当归四逆汤中阿魏酸，芍药苷回收率测定结果见表5，表6。表5结果表明，阿魏酸平均回收率为102.1%，RSD为 3.3%，方法不存在系统

误差，符合实验要求。表6结果表明，芍药苷平均回收率为107.5%，

RSD为 5.4%，方法不存在系统误差，符合实验要求。

6. 当归四逆汤中阿魏酸和芍药苷含量测定结果见表7，表8。从表7中可以得到当归四逆汤合煎液中阿魏酸平均含量为0.88mg/g，RSD为1.7%；单煎合并液阿魏酸平均含量为0.55mg/g，RSD为1.0%，说明当归四逆汤合煎液中阿魏酸含量高于单煎合并液。从表8中可以得到当归四逆汤合煎液中芍药苷平均含量为0.40 mg/g，RSD为1.5%；单煎合并液芍药苷平均含量为0.36 mg/g，RSD为1.6%，说明当归四逆汤合煎液中芍药苷含量高于单煎合并液。

附图：

图8芍药苷的标准曲线

附表

讨论

1 由表1，2的结果可以看出，阿魏酸和芍药苷的精密度良好，表3，4表明阿魏酸和芍药苷稳定性较好，而表5，6表明阿魏酸和芍药苷重复性较好。表7，8表明方法不存在系统误差，符合实验要求。

2 由表9，10的结果可以看出，阿魏酸和芍药苷在当归四逆汤合煎液中的含量要高与单煎合并液。阿魏酸和芍药苷为当归四逆汤有效成分，故从本研究的结果可以得出，在当归四逆汤药味合煎的过程中，可以显著增加有效成分的溶出，从而保证用药的疗效，也说明了当归四逆汤方中诸药配伍的科学性。

3 该方法简单快捷，结果可靠，可作为当归四逆汤质量控制的方法。同时，本研究也为进一步探讨该方的药理学和药代动力学提供了试验基础，具有重要意义。

4 本实验用水为溶剂提取当归四逆汤中阿魏酸和芍药苷，具有溶剂无毒、廉价的优点。

5 本实验通过HPLC法，研究了当归四逆汤合煎液与单煎合并液中阿魏酸和芍药苷的含量，方法简便快速，重复性好，测定结果准确，可作为该方的临床应用提供参考，得出合煎液中阿魏酸和芍药苷含量均高于单煎合并液，证明中药配伍的合理性。