主题：【第七届原创】中药穿心莲药效成分的提取和分离鉴定

中药穿心莲药效成分的提取和分离鉴定

    常用中药穿心莲为爵床科穿心莲属植物穿心莲Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees.的干燥地上部分，秋初茎叶繁盛时采割，晒干。《中华人民共和国药典》（2010版 一部）记载穿心莲：苦，寒；归心，肺，大肠，膀胱经。具有清热解毒，凉血消肿之效，是一种来源广，毒副作用少的常用中草药。临床上常用于治疗感冒，扁桃体炎，支气管炎，急性菌痢，胃肠炎等多种感染性疾病。全世界穿心莲属约有20种，中国约有5种，其他四种为刺穿心莲A.echioides Nees，疏花穿心莲A. laxiflora (Bl.)Lindau，西穿心莲A.serpyllifolia Wight和魏氏穿心莲A. wightiana Arn.exNees，均为药用植物。穿心莲始载于《岭南采药录》，原产于热带及亚热带地区，由华侨引种，现国内华东，华南及西北均有栽培。

  穿心莲属植物大都具有良好的药理作用，我国用药多为穿心莲，历代本草书中都对穿心莲的药理作用有记载：《泉州本草》“味苦，性寒，无毒”；“入心，肺二经”。常用于抗菌、抗病毒、舒血管降血压。临床上多用于治疗各种感染性疾病、钩端螺旋体病、肠伤寒、毒蛇咬伤等。

    药理作用：包括抗菌，抗炎,解热作用；对心肌缺血具有保护作用；减轻心肌缺血再灌注损伤(IRI)的作用；降压作用；对血管内皮细胞的保护作用等。

    临床应用：穿心莲在临床上主要用于治疗心血管疾病，急性上呼吸道感染、婴幼儿慢性腹泻、胃炎和烧伤，并用以辅助药物流产。合用其他中药时，对急性黄疸性肝炎、神经性皮炎、湿疹、血栓闭塞性脉管炎、鼻衄、口腔出血、小儿消化不良、痢疾等疾病的疗效也很好。

    文献报道，穿心莲的主要成分为二萜内酯类和黄酮类化合物，其中二萜内酯类成分为穿心莲的主要药效成分。本试验意在从中药穿心莲中提取并分离得到该类成分，并对其作出化学成分的鉴定，开发潜在的先导化合物为进一步开发新药奠定基础。

    实验仪器与材料：熔点用YANACO MP-S3熔点测定仪(Yanaco AnalyticalInstruments, Kyoto)测定；

紫外光谱用3D-HPLC中PAD检测器测定；

ESI-MS采用Agilent 1100-LC/MSDTrapSL mass spectrometer (Agilent, USA) 测定；

核磁共振谱采用Bruker ARX-300和 Bruker ARX-600型核磁共振谱仪（Bruker, German）测定；

分析型高效液相色谱：①泵为Waters 600 controller (Waters, USA), 检测器为Waters 996 photodiodearray detector (Waters, USA)，色谱柱为安捷伦SB-C184.6 umx150mm

制备型高效液相色谱：①泵为PU-986 intelligent prep. pump (JASCO,Japan), 检测器为UV-975 intelligent UV/VISdetector (JASCO, Japan),

旋转蒸发仪（EYELA）；

循环水式多用真空泵（郑州长城）；

实验材料

穿心莲药材购自药店

硅胶（100-140目，青岛海洋化工厂）；

Sephadex LH-20 (Pharmacia，Sweden )；

硅胶薄层板为实验室自制（硅胶为G，板大小分别为10 × 10 cm, 20 × 20 cm, 25.4 × 76.2 mm, 黏合剂为羧甲基纤维素钠，浓度为0.4%，与硅胶比例为3:1）；

氘代试剂为CDCl₃（上海皓素化学技术有限公司产品）；

色谱层析用化学试剂为天津康科德科技有限公司为分析纯或色谱纯。

试验用水为实验室自制

实验部分:穿心莲药材100g,用85%乙醇回流提取两次（第一次8倍量，第二次6倍量），每次两小时，合并提取液， 45℃条件下减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏（AP，12g）。总浸膏分散到5倍量的水中，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，45℃条件下减压浓缩得到乙酸乙酯层浸膏（APE，5g）。运用了反复开放硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、制备薄层色谱以及反相HPLC等手段，对穿心莲的乙酸乙酯层浸膏进行了系统分离并已鉴定化合物为脱3，14-二去氧穿心莲内酯、8(17), 13-ent-labdadien-16,15-olid-19-oic acid、phlogantholide-A和穿心莲新苷，详细分离流程如下：

其中化合物一：3，14-二去氧穿心莲内酯




无色针状结晶 (MeOH)，mp 93-94 ℃；10%硫酸乙醇显紫红色，Legal和Kedde试剂反应阳性；UVl_max nm(MeOH): 205；ESI-MS m/z：319 [M+H]⁺，317 [M-H]^-；¹H-NMR (300 MHz, C₅D₅N)，δ(ppm)：0.67（3H，s，20-Me），0.98（3H，s，18-Me），，3.62(1H, d, J=10.6Hz19-Ha)，4.01(1H, d, J=10.6Hz19-Hb)，4.76（1H，s，17-Ha），4.96（1H，s，17-Hb），4.77(2H，s，15-H₂)，7.21（1H，brs，14-H）；¹³C-NMR (75 MHz, C₅D₅N)

液相图谱如下：

化合物2：8(17), 13-ent-labdadien-16,15-olid-19-oic acid




白色粉末(MeOH)； Legal和kedde试剂反应阳性； ¹H-NMR (300 MHz, in CDCl₃)：d 7.08(1H, t,J=1.3 Hz, H-14), 4.75(2H, d, J=1.7 Hz, H-15), 4.61(1H, brs, H-17a), 1.02(3H, s, Me-18), 4.88(1H, brs, H-17b), 3.36(1H, d, J=10.8 Hz, H-19a), 3.64(1H, d, J=10.8 Hz, H-19b),0.68(3H, s, Me-20)；¹³C-NMR (75 MHz, in CDCl₃)

化合物3phlogantholide-A




白色粉末(MeOH)； Legal和kedde试剂反应阳性； ¹H-NMR (300 MHz, in pyridine-d₅)：d 7.21(1H, s, H-14), 4.77(2H, s,H-15), 4.77(1H, o, H-17a),4.99(1H, s, H-17b), 1.34(3H, s, Me-18),0.90(3H, s, Me-20)；¹³C-NMR (75 MHz, in pyridine-d₅)：。

化合物1、2、3共薄层情况




化合物4穿心莲新苷






无色针状结晶（MeOH），10%硫酸乙醇显紫红色，Legal和Kedde试剂反应阳性，Molish反应阳性。UVl_max nm (MeOH): 205，取穿心莲新苷对照品，与该化合物进行共薄层，并通过HPLC-PAD同时进针检测，发现薄层色谱为同一个点，HPLC上为同一个正态峰,紫外吸收完全相同。

化合物四与穿心莲新苷对照品共薄层情况

小结与讨论：本次试验我们综合运用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、PTLC及PHPLC等色谱分离手段从穿心莲药材85%乙醇提取物经萃取后的乙酸乙酯部位中分离得到4个二萜内酯类化合物，对于本实验室开发具有潜在成药的先导化合物奠定了基础。