主题：【第七届原创】HPLC法同时测定舒肝丸中三种有效成分的含量

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Kromasil C18柱（4.6mm×250mm，5µm）流动相甲醇和0.2%磷酸（按以下梯度进行洗脱），柱温35℃，流速1.0 mL·min ^{－ 1} ，进样量10μL;波长254nm。

2.2 对照品储备液

  精密称取龙胆苦苷、栀子苷、黄芩苷对照品约10mg, 置100ml量瓶中，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1024、1034、1058mg的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备[1]

    取本品，研细，取约1g,置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml,密塞，称定重量，超声处理20（250W，频率40kHz)分钟，放冷，在称定重量，用50％甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.4线性关系考察

  精密量取龙胆苦苷对照品、栀子苷对照品、黄芩苷对照品储备液0, 1, 2, 3,4mL, 分别置5 mL量瓶中, 用甲醇定容, 摇匀, 即得5个浓度的对照品溶液, 分别进样10μL, 测定峰面积积分值。以进样量(μg)为横坐标, 峰面积积分值为纵坐标, 进行线性回归, 龙胆苦苷回归方程为:Y= 1.399X + 5.058 r= 0.9998龙胆苦苷进样量在0.525～5.25μg范围内线性关系良好。栀子苷回归方为:Y= 3.409X + 6.128 r= 0.9996栀子苷进样量在0.635～6.35μg范围内线性关系良好。黄芩苷回归方为:Y= 12.356X + 9.467 r= 0.9996黄芩苷进样量在10.658～106.58μg范围内线性关系良好。

2.5精密度

取2.2项下的对照品储备液适量, 用甲醇稀释成0.0525mg/mL的对照品溶液, 连续进样6次, 记录龙胆苦苷的峰面积积分值, 计算RSD( n= 6)为0.32%, 表明精密度良好。同理，栀子苷峰面积RSD( n= 6)为0.57%，黄芩苷峰RSD( n= 6)为1.12%

2.5重复性实验

  取舒肝丸样品1共6份, 每份1g, 精密称定, 依2.3项下方法制备供试品溶液, 进样测定, 外标法计算龙胆苦苷含量。结果舒肝丸制剂中龙胆苦苷含量平均值(n=6)为0.28%, RSD为1.4% , 栀子苷含量平均值(n=6)为0.36%, RSD为1.1% , 黄芩苷含量平均值(n=6)为0.73%, RSD为1.0% , 表明方法的重复性良好。

2.6 稳定性实验

取舒肝丸样品1的供试品溶液, 在本文色谱条件下, 每隔4 h进样1次, 共6次, 结果龙胆苦苷峰面积积分值的RSD(n=6)为0.97% ,栀子苷峰面积积分值的RSD(n=6)为1.03% 黄芩峰面积积分值的RSD(n=6)为0.91% 表明供试品溶液在24h内稳定。

2.7 加样回收率实验

  取已测知龙胆苦苷、栀子苷、黄芩苷含量样品6份, 每份1g, 精密称定。分别加入0.0208 mg/mL的对照品溶液5 mL,依2.3项下方法制备供试溶液, 进样测定, 计算回收率。结果龙胆苦苷平均回收率(n=6)95.6%,RSD为1.08%。栀子苷平均回收率(n=6)97.04%,RSD为0.58%。黄芩苷平均回收率(n=6)99.24%,RSD为0.37%。

2.8 样品测定

取不同来源舒肝丸样品, 依2.3项下方法制备供试品溶液, 在2.2项色谱条件下进样测定, 以外标法计算各样品中龙胆苦苷、栀子苷、黄芩苷含量。结果如下表所示。

                                图1    龙胆苦苷HPLC图谱

                                图2  龙胆苦苷和栀子苷混合对照品HPLC图

                                    图3  黄芩苷HPLC图谱

                              图4  供试品HPLC图谱

3.讨论

3.1  分别考察了甲醇、乙醇、70%乙醇提取 、50%甲醇提取 等溶剂，发现50%甲醇出峰较好，分离效果好。

3.2 我们分别采用了 甲醇-水  乙腈-水 甲醇-磷酸水系统进行梯度洗脱，发现254nm下，甲醇-磷酸水系统基线较为平整，且完全达到基线分离。

3.3  本文所建立的HPLC法同时测定舒肝丸制剂中龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的方法，能够将目标化合物完全分离，方法简单，快速。

3.4 本文对三批制剂进行了含量测定，为该制剂的进一步研究开发及质量控制提供科学依据。

参考文献：

[1]中国药典.一部..2010:652

[2]冯亦颖.高效液相色谱法测定龙胆泻肝丸中黄芩苷的含量[J].天津药学，2007,19（5）：15

[3]张青云.HPLC法测定龙胆泻肝丸(水丸)中栀子苷的含量[J].安徽医药，2008（7）