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兽药之硫酸粘杆菌素高效液相色谱法检测
硫酸粘杆菌素由多粘杆菌产生,对革兰氏阴性菌有很强的抗菌作用,治疗革兰氏阴性菌(大肠埃希菌等)引起的肠道疾病效果明显,常用作饲料添加剂。对绿脓杆菌感染(败血症、尿路感染、烧伤或外伤创面感染)也有很好的效果。用于饲料添加剂还有明显促生长作用,和磺胺嘧啶合用效果更好。 本品也有很多副作用,内服很少吸收,本品吸收后,对肾脏和神经系统均有明显毒性。使用时剂量过大或疗程过长,以及注射给药和肾功能不全时均有中毒危险。 所以这种东西对于某些症状疗效较好,但也得谨慎使用。检测某些产品中硫酸粘杆菌素的含量就显得尤为重要。下面我们就重点看看高效液相色谱法检测某饲料中硫酸粘杆菌素吧。实验部分原理 取适量该粉末样品加10%甲醇溶解超声提取,经进样器进入高效
液相色谱系统,C18色谱柱分离,紫外检测器检测,保留时间定性,峰面积定量计算(外标法)。
仪器及试剂1.仪器:高效液相色谱仪(紫外检测器)、分析天平、超声振荡器、溶剂过滤器2.试剂:甲醇、乙腈(均为色谱纯),纯净水,硼砂溶液样品处理 提取方法:取饲料样品适量,充分粉碎后过0.45mm孔径筛后,装入磨口瓶中备用。准确称取上一步处理过的饲料样品5g,加入150ml 10%的甲醇水溶液,超声波提取20min。将提取液全部转移到1000ml鸡心瓶中,70℃旋转蒸发器蒸至近干,用去离子水溶解并定容至1ml,0.45um有机微孔滤膜滤过,待测。色谱条件检测器:紫外检测器色谱柱:C18,4.6 X 250mm,5um检测波长:215nm流动相:乙腈:PH6.0的硼砂缓冲液=70:30(V:V)流速:1.0mL/min进样量:10ul柱温:室温目标物:硫酸粘杆菌素B,硫酸粘杆菌素A标准品色谱图:标准品,三次平行进样交错叠加色谱图:样品色谱图:样品,三次平行进样交错叠加色谱图:以下是定性、定量数据: | 序号 | 保留时间(min) | 峰面积 (μAu*s) |
标样-1 | 1 | 13.533 | 1262989 |
2 | 28.767 | 1306312 |
标样-2 | 1 | 13.533 | 1275709 |
2 | 28.767 | 1309446 |
标样-3 | 1 | 13.533 | 1262400 |
2 | 28.783 | 1302764 |
样品-1 | 1 | 13.55 | 2311378 |
2 | 28.767 | 1164616 |
样品-2 | 1 | 13.567 | 2319845 |
2 | 28.817 | 1165157 |
样品-3 | 1 | 13.583 | 2329037 |
2 | 28.833 | 1176529 |
从以上色谱图可以看出,硫酸粘杆菌素B,硫酸粘杆菌素A分离度很好,定性、定量重复性很一致,准确度很高。该方法非常实用于饲料样品中硫酸粘杆菌素检测。 采用该方法或相关方法检测该样品时需要注意的几点:1.样品前处理时超声波提取一般20min就可以,但有时由于温度低、超声波功率小等原因,20min不够。那就得适当延长提取时间,或适当控制超声波温度(超声波有控温功能的可控温50℃,没有控温功能的,可在超声波中加入50℃左右的温水)以保证样品中硫酸粘杆菌素B,硫酸粘杆菌素A完全溶解。2.很多方法中提到液相泵流速0.7ml/min,其实这样的效果也很好。0.7ml/min的流速,流动相一般为乙腈:PH6.0的硼砂缓冲液=75:25(V:V)。但一般的等度液相和色谱柱1.0ml/min流速效果更好,那样流动相最好选择乙腈:PH6.0的硼砂缓冲液=70:30(V:V)。3.检测这个样品时,色谱柱温度大家大多都选室温,其实为了保证定性、定量分析的准确度,最好还是要对色谱柱控温。如果为了减短分析时间,还可以适当增加色谱柱温度。4.检测这个样品时,一般的方法进样量是20ul,这样对于硫酸粘杆菌素A色谱峰偏宽,偏低。如果把进样量改为10ul,色谱峰峰宽会明显变窄,峰形明显变好。如果嫌色谱峰低,可以适当增加样品浓度。以上是本人做该样品分析的一些经验和体会,希望能给大家带来帮助。也非常希望大家能多提宝贵意见和建议,以相互学习,共同进步。谢谢大家!