女贞叶为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的叶，具有清热明目，解毒散瘀，消肿止咳之功效。主要用于头目混痛，风热赤眼，疮肿溃烂，烫伤和口腔炎。三萜类化合物是女贞叶中的主要活性成分，目前对女贞叶的含量测定的相关报道较少，大多为测定其中一个或两个三萜类成分，不能全面、有效地评价女贞叶的整体质量。本实验建立了同时测定了19α-羟基熊果酸、2α-羟基熊果酸、3β-反式对羟基肉桂酰氧基-2α-羟基齐墩果酸、齐墩果酸、熊果酸5种三萜类成分的高效液相色谱法，为女贞叶的质量控制提供科学依据。

1 仪器与材料

Agilent 1100液相色谱仪，BS210S型电子天平（德国Sartorius公司），电热恒温水浴锅（上海精宏）；乙腈、甲醇为色谱纯（美国J.T.Baker）水为Milli-Q超纯水，其余试剂均为分析纯。

熊果酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110742-200415）；齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110709-200304）；19α-羟基熊果酸对照品、2α-羟基熊果酸对照品及3β-反式对羟基肉桂酰氧基-2α-羟基齐墩果酸对照品[6]（均为自制对照品，纯度均>98%）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备分别取5种对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含19α-羟基熊果酸28.50 μg、2α-羟基熊果酸49.44 μg、3β-反式对羟基肉桂酰氧基-2α-羟基-齐墩果酸8.11 μg、齐墩果酸149.8 μg、熊果酸345.5 μg的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备取女贞叶粉末约4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇50 mL，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，既得。

2.3 色谱条件

色谱柱：大连依利特Kromasil C18液相色谱柱（4.6 × 250 mm，5 μm）；

流动相：甲醇-乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液(53:27:20)；

检测波长：205 nm；

流速：1.0 mL/min；

柱温：15 ℃；

进样量：10 μL。

HPLC图谱见图1 。

图1 混合对照品（A）与女贞叶样品（B）液相色谱图

1. 19α-羟基熊果酸 2. 2α-羟基熊果酸 3. 3β-反式对羟基肉桂酰氧基-2α-羟基齐墩果酸 4. 齐墩果酸 5. 熊果酸

3 讨论

19α-羟基熊果酸、2α-羟基熊果酸、3β-反式对羟基肉桂酰氧基-2α-羟基齐墩果酸、齐墩果酸、熊果酸五中物质的母核结构相同，最大吸收波长均在203～206 nm，在205 nm处所得结果灵敏度较高，其他色谱峰干扰较少，故选择波长为205 nm。由于齐墩果酸和熊果酸为同分异构体，性质相似，给分离带来较大困难，曾以甲醇-水、乙腈-水等系统[6-10]，并在流动相中加入磷酸、冰醋酸、乙酸铵等试剂，通过调整比例，最后选用甲醇-乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液(53:27:20)作为流动相。此外，柱温对熊果酸与齐墩果酸的分离影响很大，温度越低分离度越高。采用资生堂CAPCELL PAKC18（250×4.6 mm，5 μm）考察，柱温为35℃时，熊果酸与齐墩果酸的分离度为1.56，30 ℃时，熊果酸与齐墩果酸的分离度为1.60，而15 ℃时，熊果酸与齐墩果酸的分离度可以达到3.0，从而得到很好的分离效果，最终确定柱温为15 ℃。

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