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在试样反相高效
液相色谱分析中,条件的优化与选择尤其重要,改变不同的仪器操作条件会得到不同的效果,下面是本人在
液相色谱分析中得到的一点心得,分享一下,不妥之处请各位版友多多指教!
1:试样品分析对反相色谱柱的选择
不同的反相色谱柱,在柱温 波长 流速以及流动相配比 相同的条件下:分离度不同----表现为各组分的保留时间不同。灵敏度不同----表现为峰高和峰面积不同。(下图引用自“中国药科大学色谱分析课程”)
2:试样品反相色谱分析对波长的选择
同一个反相色谱柱,在柱温 流速 流动相配比相同而波长不同的条件下:分离度不同-----表现为波长越大,分离度越大;波长越小,分离度越小,基线噪音越大。灵敏度不同-----表现为波长越大,灵敏度越低;波长越小,灵敏度越高。试样的保留时间不随波长的改变发生变化。
说明:1:在反相
液相色谱分析中,分离度大小与反相色谱柱的性能 柱温 流速 流动相的性质和配比有关系,与试样品的性质有关系。试样各组分在通过色谱柱而没有通过紫外检测器之前,保留时间以及分离度的大小就已经确定了,只是在通过紫外检测器时,由于紫外检测器波长发生了变化,紫外检测器的灵敏度(即单位浓度或单位质量的试样品通过紫外检测器检测到的信号强度)发生了变化,致使试样品各组分的峰高 峰面积发生变化,在表现形式上表现为分离度不同 灵敏度不同。2:尽管波长发生了不同的变化,但是,各组分的保留时间没有发生变化。这充分说明了各组分被洗脱的强度只与自身的性质(极性的强弱)以及色谱柱的性质(反相色谱柱)和柱温 流速 流动相的配比(流动相的极性)有关系。3:同种物质在不同的波长下紫外吸收不同,最大紫外吸收的波长为这种物质的截止波长,在反相
液相色谱分析中,波长的设置都是流动相没有紫外吸收的波长,流动相如果有紫外吸收就会造成基线噪音和基线漂移。4:规定的范围内,波长越大,灵敏度越低,可以理解为:由于波长的增大,被测物的紫外吸收减弱,当被测物通过紫外检测器时,紫外检测器检测到的被测物的信号强度减弱,表现为峰高变低,峰面积变小,灵敏度降低。
3:试样品反相
液相色谱分析对流动相配比浓度的选择
同一个反相色谱柱,在柱温 波长 流速相同,而流动相配比浓度(极性大小)不同的条件下:分离度不同(极性较小的试样)-----表现为流动相浓度增大(流动相极性减小),分离度降低,试样(极性较小的试样)保留时间缩短;流动相浓度减小(流动相极性增大),分离度增大,试样(极性较小的试样)保留时间延长。灵敏度不同(极性较小的试样)-----表现为流动相浓度增大(流动相极性减小),灵敏度增大;流动相浓度减小(流动相的极性增大),灵敏度减小。
说明:在反相
液相色谱分析中,流动相浓度的改变就会造成流动相极性的改变。流动相浓度降低,流动相的极性增强,在反相色谱柱中的洗脱能力减弱------极性较大的试样先被洗脱,出峰时间早,保留时间变小;极性较小的试样后被洗脱,出峰时间晚,保留时间变大。流动相浓度增大,流动相的极性减小,在反相色谱柱中的洗脱能力增强-----极性大的试样后被洗脱,出峰时间晚,保留时间变大;极性较小的试样先被洗脱,出峰时间早,保留时间变小。
4:试样品反相
液相色谱分析对流速的选择
同一个反相色谱柱,在柱温 波长 流动相配比相同而流速不同的条件下:分离度不同(极性较小的试样)-----表现为流速增加,分离度减小,试样保留时间减小;流速减小,分离度增加,试样保留时间增大。灵敏度不同(不明显)-------表现为流速增大,灵敏度减小;流速减小,灵敏度增大。