主题:【第八届原创】PCR引物设计探讨

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小志1
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设计引物是PCR片段扩增的第一步,而引物设计的好与坏直接决定了实验能否顺利开展,因此,设计引物这一步十分重要。目前,设计引物的方法多种多样,主要可以分为两类,一类是软件设计,最常用的的是PRIMER系列,现在已经有到版本Primer6,这一类只需将软件下载到电脑上并安装好即可离线使用。一般正版的需要付费,但是网上提供多种破译版下载。在安装好的软件上输入目的片段核酸序列,设置好扩增片段要求,引物要求,即可直接生成多对引物。另一类是在线设计,设计引物的网站有许多,一般用的较多的有NCBI,Primer 3,Primer Life,DoPrimer等等,用起来也很方便,操作基本和软件设计一致。
下面简单介绍下NCBI设计步骤:
1 打开NCBI主界面,选择右边的BLAST

2 拖到页面下方,选择Primer-BLAST

3 输入自己序列,进行引物要求设置,点击Get Primer即可获得引物

  这么多种设计引物的方法,看起来设计引物是一件十分简单的事情,然而这个情况只占大部分。这是什么意思呢?首先,每一个引物设计途径能给出多对引物,并且不同途径给出的引物也不尽相同,那么该选择哪一条引物是适用的呢?其次,片段长度不同,片段结构差异对引物有不同的需求,因此,通常情况下我们通过软件可以获得有效引物,但是仍旧存在引物不可用的情况。
  面对这些情况要怎么解决呢?
(1)规范操作。在设计引物参数设置时尽可能地规范,按照引物设计原则和自身要求,筛选出最好的引物。
(2)汲取经验。询问师兄师姐们,他们常用的引物设计软件是什么,不同实验室不同物种适用的软件会有差别,不能一概听信网上的推荐。
(3)多多实践。自己用不同途径设计引物,进行对照,选择最适合自身实验的方法。

  引物设计好后,PCR扩增程序设定是影响引物效果的因素之一,比如退火温度过低,可能扩增出多条带或者无带等。实验过程中每一步都很重要,所以做实验的需要有耐心和细心,实验才能顺利进行下去。
该帖子作者被版主 又又199030积分, 2经验,加分理由:第八届原创大赛积分奖励
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又又1990
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这个过程是楼主设计的吗?效果怎么样呢?
高雅林
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