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主题：【分享】眼见为实：视频原子力显微镜显示实时CRISPR基因编辑

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发表于：2018/07/31 15:01:45 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
        自2012年以来，研究人员常用一种叫做CRISPR的强大“基因组编辑”技术对生物的DNA序列进行修剪、切断、替换或添加。CRISPR来自微生物的免疫系统，这种工程编辑系统利用一种酶，能把一段作为引导工具的小RNA切入DNA，就能在此处切断或做其他改变。


        CRISPR已经成为生命科学领域最受关注的基因编辑技术，其效果得到大家一致认可。虽然科学家可通过RT-PCR、WB等方法间接证明CRISPR的功能，但仍未有直接的证据来证实。究其原因：一是生物分子间的相互作用速率快，需要高速的成像手段才能捕捉到；二是生物分子比较小，通常为纳米级，普通显微镜由于受光学衍射极限所限不能分辨。最近，日本Kanazawa University的科学家利用视频原子力显微镜HS-AFM 成功观察到了实时CRISPR基因编辑，为CRISPR技术的有效性提供了直接的证据。
HS-AFM视频结果直观显示构象差异：

HS-AFM视频结果显示apo-Cas9为柔性构象（flexible conformations），而Cas9-RNA则为稳定的双叶型构象（stable bilobed architecture）。


Cas9-RNA介导的PAM依赖性DNA识别：

Cas9-RNA靶向定位到目的DNA，形成Cas9-RNA-DNA复合体。


Cas9-RNA对目的DNA进行剪切：



在Mg2+存在的条件下，Cas9-RNA对目的DNA进行特异性剪切。


        这项工作的完成主要借助了日本RIBM公司研发的超高速视频原子力显微镜HS-AFM，HS-AFM突破了传统原子力显微镜“扫描成像速慢”的限制，能够实现在液体环境下超快速动态成像，分辨率为纳米水平。待测样品无需特殊固定，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子互作动态观测。推出至今，全球已有80多位用户，发表SCI论文200余篇，其中包括Science, Nature, Cell 等顶级杂志。

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