主题：【第十七届原创】激光共聚焦扫描显微镜使用与维护管理

激光共聚焦扫描显微镜使用与维护管理

张瑶

激光共聚焦扫描显微镜（Laser Confocal Scanning Microscope, LCSM）是生命科学研究中使用最为广泛的成像仪器，它在细胞生物学、遗传学、生物化学与分子生物学、生物医学、药学、材料学、石油化工等学科研究领域起到不可或缺的作用，它主要对细胞、组织、植物、微生物以及各种材料进行表面分析。

1、使用与维护管理

1.1样品准备

样品的制备对成像结果有着直接影响。共聚焦显微镜的样品类型很多，包括细胞、组织切片、微生物、植物以及材料，样品形式可以是固体也可以是液体。样品制备好后需要放在耗材上才能在显微镜系统下观察，耗材一般有玻片、细胞爬片、共聚焦小皿以及多孔板等，使用 20 倍及以上物镜时，盖玻片厚度≤0.17mm，或者专用共聚焦小皿底厚33mm^[1]。

不同功能模块测试的要求不同，务必提前了解。不论是组成表达荧光蛋白质的样品的检测，还是免疫荧光染色后的样品的检测，首先都需要考虑激发波长和发射波长与仪器配备的激光系统和扫描系统的光谱匹配程度，以确保最佳成像效果。多色成像时，不要选择波长接近或有交叉重叠的染料，避免出现串色。

免疫荧光染色操作步骤复杂并对科研人员的手法要求严格，在对细胞或组织进行免疫荧光染色时，一定要注意封闭以及固定的方法，封闭一般使用脱脂牛奶，而固定一般使用甲醇或PFA（多聚甲醛）；此外封片时可以加入抗淬灭剂来减弱淬灭^[2]。

1.2 显微镜使用

在使用显微镜时，一般从低倍镜开始找视野，找到视野后再切换高倍镜观察。根据样品大小及放大倍数选择合适物镜，使成像更清晰，通常情况下，物镜放大倍数越高，成像视野越小。使用完毕后，对于油镜需要先用无水乙醇擦干镜油，再切换为低倍镜，并将镜头高度降到最低。

1.3 激光器使用

激光器维护的关键措施之一是防震、维持恒温恒湿、洁净无尘环境^[3]，一直稳定维持在22±1℃、湿度≤60%。震动，及经常变化的温度、湿度，会导致光纤经常性的松紧变化，从而松动了固定光纤束的螺丝，最终导致光路偏移，其后果现象和解决将在后面介绍。灰尘颗粒会进入激光器的内部，影响内部精密构件。

1.4 数据处理

对于共聚焦数据，获得好的拍摄照片是基础，但后期的数据处理分析和统计也很重要，配套软件可对数据进行一般的处理，可进行荧光强度、寿命的测量，标尺的添加，对比度的调节。另外我们也可以借助其它软件如：Image J、Imaris、Aivia等。

总结

综上所述，LCSM的维护工作尤为重要，LCSM作为一款精密仪器设备，组成部件复杂，同时适用于多种样品，所以要求测试人员要掌握一定的基础知识、操作方法，能对出现的问题进行判断并及时解决问题，做好仪器的日常维护，使激光扫描共聚焦显微镜能对科研工作做出最大的贡献。

参考文献：

[1] 李成辉,田云飞,闫曙光.激光扫描共聚焦显微成像技术与应用[J].实验科学与技术,2020,18(04):33-38.

[2]刘如明,边鑫,龙加福,等.融合免疫荧光技术的共聚焦显微镜实验教学实践[J].实验室研究与探索,2023,42(07):229-232.

[3] 王炜.激光共聚焦显微镜的使用和管理[J].科技资讯,2011,(21):116