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液相色谱（LC）

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主题：【求助】用安捷伦氨基酸分析包遇到的问题——基线鼓包和三组氨基酸达不到基线分离

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书虫90

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发表于：2018/08/11 13:54:47 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

用安捷伦氨基酸分析包遇到的问题——基线鼓包和三组氨基酸达不到基线分离，请各位大神帮忙看看是什么原因导致的
样品：多肽酸水解后通过0.45um膜，取其续滤液
色谱柱： Agilent ZORBAX Eclipse AAA 4.6*150mm 5um
流动相：A相：40mM NaH2PO4 (pH=7.8)
B相：甲醇：乙腈：H20=45:45:10
NaH2PO4 是国药分析级，甲醇、乙腈是色谱纯，H2O是密理博纯水仪制水
检测波长：338nm、262nm
流速：2.0ml/min
柱温： 40℃
梯度时间min A B
0 100 0
1.9 100 0
18.1 43 57
18.6 0 100
22.3 0 100
23.2 100 0
26 100 0
问题一、色谱柱使用了一段时间后在7-9min出现鼓包，影响了氨基酸的定量
问题二、重现不了安捷伦的图谱，Gly/Thr、Val/Met、Phe/Ile达不到基线分离。
以下图谱依次为：基线鼓包的标准品图谱、正常标准品图谱、基线鼓包的空白、三组氨基酸没有基线分离、安捷伦分析包标准品图谱

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sdlzkw007

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2018/8/11 18:00:19 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

看来是样品检测过程中的基质残留物在柱子上，建议冲洗一下试试；基线分离原来可以的话就是色谱柱脏了，柱效下降的原因

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书虫90

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2018/8/12 8:49:29 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

冲洗一个晚上没有效果，很揪心。有时冲2天才冲干净，用不了多久又有鼓包。柱子是刚买的。重现不了分析包分离效果

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夏天的雪

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2018/8/13 9:12:41 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1、按照您的描述，冲洗色谱柱后基线鼓包还是可以消失的，说明鼓包应该是污染引起的，还是考虑冲洗，是否可以在程序完成之后加一个高比例有机相冲洗的过程，或者延长18-22min的时间；2、空白色谱图中也有许多小峰，考虑污染或者试剂纯度不够引起的；3、重现性与方法和仪器有关的，您的色谱柱及仪器条件是否与安捷伦的一样，看分析包的谱图，部分峰的分离度本来就很低，稍微有些差别就可能影响他们的分离

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moviehua

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2018/8/13 9:47:50 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

NaH2PO4 是国药分析级，甲醇、乙腈是色谱纯，这些换成进口LC/MS 级别试试。

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dadgoh

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2018/8/13 9:56:29 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 书虫90(v2847808) 发表:冲洗一个晚上没有效果，很揪心。有时冲2天才冲干净，用不了多久又有鼓包。柱子是刚买的。重现不了分析包分离效果

冲洗可另设梯度，流量小谢更有利。

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2018/8/13 12:04:03 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

每天走完样品都会设置冲洗先高比例的水相后面是高比例的乙腈低流速冲洗30-40分钟。还是冲不掉，反接低流速的乙腈冲洗7小时还是冲不干净，扎心

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2018/8/13 14:22:06 7楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 夏天的雪(bingwang228) 发表:
1、按照您的描述，冲洗色谱柱后基线鼓包还是可以消失的，说明鼓包应该是污染引起的，还是考虑冲洗，是否可以在程序完成之后加一个高比例有机相冲洗的过程，或者延长18-22min的时间；2、空白色谱图中也有许多小峰，考虑污染或者试剂纯度不够引起的；3、重现性与方法和仪器有关的，您的色谱柱及仪器条件是否与安捷伦的一样，看分析包的谱图，部分峰的分离度本来就很低，稍微有些差别就可能影响他们的分离

1、鼓包问题应该是多肽酸水解后直接衍生进样对色谱柱造成污染，可以将酸水解后的样品进行前处理（不知道该怎么前处理，过一根C18），或者增加高比例有机相冲洗（不过实际操作上，冲洗的效果不理想，100%纯乙腈冲洗一天也没用）2、试剂用的是天地，没有默克的。我想想换换试剂，无奈 3、色谱柱、衍生试剂、标准品全部购买安捷伦的，色谱参数按照安捷伦提供的分析包设置，一模一样。

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