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主题：【已应助】蛋白表达纯化

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发表于：2020/10/28 17:42:19 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
各位大神们，本人小白一枚，最近在把重组的大肠杆菌破壁离心，取上清过柱子，纯化酶，但是酶活非常低甚至没有了，正在找问题，请各位大神指教啊，（1）用来破壁的液体，一般要用pbs缓冲液嘛，ph多少的，pbs里面要加氯化钠嘛，一般ph是多少？（2）我上的镍柱，结合液是20mmol/L的pbs.ph值为7.4的，里面还加了0.5mlo/L的氯化钠，5mmol/L的咪唑。洗脱液是20mmol/L的pbs.ph值为7.4的，里面加了0.5mlo/L的氯化钠，500mmol/L的咪唑，我这个有没有问题呀。（3）我当时透析用的水，透析了30小时吧，用的转子，里面加的冰，换了4次水，是不是应该也要用缓冲液透析呢，用pbs嘛，那这里面不需要加盐吧。（5）我们这个酶用来降解的物质会跟pbs还有盐酸反应，我也担心测酶活时会受缓冲液影响。请各位大神指教啊
推荐答案：小卡回复于2024/09/23
1）用来破壁的液体可以用 PBS 缓冲液，pH 一般在 7.0 - 7.4 左右比较常见。是否加氯化钠要看你的具体需求，加的话浓度也需要根据实际情况调整。
（2）你的镍柱结合液和洗脱液配方看起来问题不大，但有时候可能需要根据实际情况进行微调。可以考虑检查一下各个成分的纯度是否达标。
（3）透析最好用缓冲液透析，用 PBS 可以，至于加不加盐也看你的酶的特性和后续实验需求。一般来说，如果酶比较稳定，不加盐也可以，但如果不确定，还是用有一定盐浓度的缓冲液更保险。
（5）如果担心测酶活时受缓冲液影响，可以尝试用不同的缓冲液或者不使用缓冲液进行对比实验，看看酶活的变化情况，从而确定缓冲液是否有影响。
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2024/9/23 23:03:06 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1）用来破壁的液体可以用 PBS 缓冲液，pH 一般在 7.0 - 7.4 左右比较常见。是否加氯化钠要看你的具体需求，加的话浓度也需要根据实际情况调整。
（2）你的镍柱结合液和洗脱液配方看起来问题不大，但有时候可能需要根据实际情况进行微调。可以考虑检查一下各个成分的纯度是否达标。
（3）透析最好用缓冲液透析，用 PBS 可以，至于加不加盐也看你的酶的特性和后续实验需求。一般来说，如果酶比较稳定，不加盐也可以，但如果不确定，还是用有一定盐浓度的缓冲液更保险。
（5）如果担心测酶活时受缓冲液影响，可以尝试用不同的缓冲液或者不使用缓冲液进行对比实验，看看酶活的变化情况，从而确定缓冲液是否有影响。
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