主题:【分享】鸡肉中的β-受体激动剂的检测

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β-受体激动剂是一类人工合成的肾上腺激动剂,俗称“瘦肉精”,在动物体内会提高其瘦肉率,但使用含有瘦肉精的肉类,将对人体造成极大伤害。我国相关法律法规规定禁止在生猪等食源性动物养殖过程中使用β-受体激动剂类药物。

β-受体激动剂是一类化学合成的苯乙醇胺类衍生物,根据苯环上取代基的差异,可分为苯胺型和苯酚型。苯胺结构的化合物,轭合反应率和蛋白结合率低;苯酚结构的化合物轭合代谢过程较强,药物进入人或动物体内后,通过糖苷键结合参与代谢,转换为葡萄糖醛酸轭合物或硫酸轭合物。所以β-受体激动剂的检测通常需要酶水解步骤,β-葡萄糖醛酸酶是一种可以使葡糖醛酸苷键加水分解的酶,它可以把葡萄糖醛酸轭合物或硫酸轭合物的糖苷键切断,释放出游离态。

目前,检测β-受体激动剂通常参照GB-T22286-2008方法,具体检测流程为:称量2g样品 — 加50μl酶水解12小时 - 添加内标物 - 振荡提取15min - 离心10min(5000r/min) - 移取4mL上清液加入0.1mol/L高氯酸溶液5mL,混合均匀 - 高氯酸调节PH值至1±0.3 - 离心10min(5000r/min) - 移取全部上清液至新的离心管中,用10mol/L的氢氧化钠溶液调PH至11 - 加入10 mL饱和氯化钠溶液和10 mL异丙醇-乙酸乙酯(6: 4)混合溶液,充分提取 - 离心10min(5000r/min)- 取全部有机液氮气吹干 - 加5 mL乙酸钠缓冲液(pH 5.2)复溶残渣 - 净化样品 - UPLC-MS/MS检测。

在β-受体激动剂检测过程中,酶水解是检测中的关键步骤之一,然而12小时的酶水解时间严重影响了工作效率,所以选择一种合适的酶,提高水解效率是需要解决的问题。目前,市场上的β-葡萄糖醛酸酶一般提取自鲍鱼,蜗牛,大肠杆菌,还有IMCSzyme®生物工程改良的β-葡萄糖醛酸酶,相较其他同类产品,IMCSzyme®活性、纯度得到显著提高。 IMCSzyme® 不仅能缩短酶解反应时间、简化后期纯化步骤,其高纯度也大大降低了对检测仪器的干扰和损害。下面我们就用实验来验证IMCSzyme®β-葡萄糖醛酸酶的性能。

参照GB-T22286-2008方法,做IMCSzyme® β-葡萄糖醛酸酶与蜗牛β-葡萄糖醛酸酶对比实验。分别取沙丁胺醇和特布他林阳性鸡肉样品2 g,加入0.2 mol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.2) 8 mL,蜗牛β-葡萄糖醛酸酶50 μL,37 ℃放置12 h;另取沙丁胺醇和特布他林阳性鸡肉样品各2 g,加入快速水解缓冲液(pH 7.4) 8 mL,IMCSzyme® β-葡萄糖醛酸酶50 μL,37 ℃放置12 h;酶解反应后,样品前处理并净化,最后UPLC-MS/MS检测。结果如图1所示,含沙丁胺醇和特布他林的阳性鸡肉样品经蜗牛β-葡萄糖醛酸酶酶解处理的测定结果分别为8.62 μg/L和9.66 μg/L;经IMCSzyme®水解测定结果分别为10.7 μg/kg和13.17 μg/kg;结果表明,采用相同的酶用量和酶解时间,IMCSzyme®对底物的水解效率高于蜗牛β-葡萄糖醛酸酶。

图1  不同酶制剂水解效率的比较



采用IMCSzyme®β-葡萄糖醛酸酶水解样品,实验设计了2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h水解时间,考察水解效率。实验步骤:分别取含沙丁胺醇和特布他林阳性鸡肉样品2 g,加入快速水解缓冲液(pH 7.4) 8 mL,IMCSzyme® β-葡萄糖醛酸酶50 μL,37 ℃分别放置2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h,酶解反应后,按照GB-T22286-2008方法进行处理并净化,UPLC-MS/MS检测。结果如图2所示,由图表明沙丁胺醇、特布他林水解2h,水解产物逐渐增多;水解2-8h,水解产物变化不大,水解超过8h,水解产物开始降解。由此推断2小时已水解已基本完成。




图2 IMCSzyme®不同时间水解效率对比



综上述实验可得,使用IMCSzyme® β-葡萄糖醛酸酶水解样品只需2小时就能水解完全,这大大的缩短了β-受体激动剂水解时间,提高了检测效率。
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