主题:【第十四届原创】黄芪总多糖的精制与含量测定

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1.黄芪多糖的精制

取黄芪药材粉末约30.0 g,精密称定,加入石油醚(6090 100 mL回流提取3次,每次1 h,弃去提取液(除去脂溶性成分),药渣烘干,用70 %乙醇150 mL回流提取3次,每次2 h。弃去提取液(除单糖、低聚糖和苷类等小分子物质),药渣烘干,加蒸馏水200 mL回流提取3次,每次2 h。合并提取液,减压浓缩至100 mL,即得粗多糖的水溶液。在粗多糖水溶液中加入Sevage试剂(氯仿正丁醇 = 4l10 mL,剧烈震荡20 min,使其充分混合,在4000 rpm转速下离心5 min,弃去中间变性蛋白层和下层有机层,水相继续重复上述操作10次,直至水相与有机相中间无变性蛋白出现为止,即得脱蛋白多糖水溶液。

向脱蛋白多糖水溶液中加入5倍量无水乙醇80mL(使溶液含醇量达80 %以上),充分搅拌,静置过夜。在4000rpm转速下离心5 min,弃去上清液,所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚20mL各洗涤3次,弃去有机溶剂后挥干沉淀,并用真空干燥机抽真空,60 干燥12h,得到灰白色颗粒状多糖样品。

    黄芪多糖精制的工艺流程图见图1

Fig.1 The isolationprocedure of the polysaccharide in Radix Astragali.



2.黄芪多糖的纯度检查

2.1 Molish 试验


1)供试品溶液:取黄芪多糖2mg,加10mL 蒸馏水,微热使溶解,再加入α-萘酚;

2阳性对照品溶液:取淀粉2 mg,加10 mL 蒸馏水,加热溶解,再加入α-萘酚;

3阴性对照品溶液:10 mL 蒸馏水,加α-萘酚。

分别摇匀,将试管倾斜,沿试管壁慢慢加入浓硫酸,竖直试管观察。供试品溶液与阳性对照品溶液试管中呈紫堇色环,阴性对照品溶液试管界面无变化。结果表明供试品溶液为糖类。

2.2 Fehling 试验

  Fehling试剂的配置:称取CuSO4.5H2O7.28 g加水至40 mL0.1 mL 浓硫酸酸化,再加水至100 mL作为甲液;称取酒石酸钾钠34.6 g,氢氧化钠14.2 g,加水至100mL 作为乙液。临用时将甲、乙液按1:1混匀即可。

1供试品溶液:取黄芪多糖2 mg,加10 mL 蒸馏水,微热使溶解;

2阳性对照品溶液:取葡萄糖2mg,加10mL 蒸馏水,微热使溶解;

3阴性对照品溶液:10 mL 蒸馏水。

分别加入Fehling试剂,在70℃水浴中加热10 min。供试品溶液与阳性对照品溶液为蓝色,阴性对照品溶液变为砖红色。单糖与Fehling试剂反应变为砖红色,而多糖为非还原性糖,不与Fehling试剂反应,结果表明供试品中不含单糖。

2.3显色条件

总多糖的测定:精密量取对照品溶液或供试品溶液0.5mL于具刻度试管中,加水补至1.0mL,再加入8%苯酚溶液1.0mL,充分混匀后,加入浓硫酸5.0mL60 ℃水浴加热15 min,取出,冷却至室温后,于487nm下测定吸光度,外标一点法测定多糖含量。
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