高效快速溶剂萃取-气相色谱质谱联用法测定土壤中的21种酚类

摘要：

建立了高效快速溶剂萃取-气相色谱质谱联用法测定土壤中化合物的方法。采用二氯甲烷/正己烷混合液萃取土壤中的酚类化合物,提取液经凝胶色谱净化、浓缩后,经气相色谱质谱进行分离和测定。使用正交实验法对比了不同条件下的提取效率，确定了水平A2B1C3为最优的萃取条件。结果表明酚类化合物含量在2.50～50 mg/L范围内线性良好,相关系数为0.995～0.999。以10g土壤样品计,方法检出限为0.02～0.07 mg/kg,相对标准偏差为3.7%～16.6%，符合标准要求，适用于土壤中酚类的检测。

关键词：酚类化合物; 高效快速溶剂萃取; 凝胶色谱; 固相萃取；土壤

酚类化合物是指芳香烃中苯环上的氢原子被羟基取代所生成的化合物。土壤中的酚类化合物主要来源于各种直接污染,同时也来自某些有机物在环境中的降解和代谢,酚类化合物通过各种途径进入土壤后, 会被吸附残留并富集在土壤中, 引起土壤环境的生态变异或破坏生态系统的物质平衡, 导致农作物减产、品质下降。在适当条件下, 被土壤吸附累积的酚类化合物还会重新释放出来。成为二次污染源。残留富集在土壤中的酚类化合物会通过食物链的富集作用最终影响到人体健康。美国、加拿大等国家对土壤中酚类化合物有控制标准, 但是对毒性的认定不同, 控制的种类和浓度标准也相差较大, 主要控制的酚类化合物有苯酚、甲酚类、氯酚类和硝基酚等[1]。

酚类化合物由于极性较强，在土壤基质中会受到氢键力，偶极作用力的影响，提取难度较大．土壤中酚类化合物的提取方法主要有索氏提取法[2]、微波提取法和加压流体萃取法[3]．索氏提取法溶剂消耗量较大，提取时间较长．相比来说，加压流体萃取和微波提取更加快速、节能，并且操作方便。本方法选用加速溶剂萃取进行酚类物质的提取。目前酚类化合物的分析方法主要有气相色谱法[4,5]、液相色谱法[6]和气相色谱-质谱联用法[7,8]，考虑到方法灵敏度与实验结果准确性。本方法采用气相色谱-质谱联用法。

1、实验部分

1.1 仪器和设备

1.1.1 Flex-HPSE 全自动高效快速溶剂萃取系统（莱伯泰科）；

1.1.3 GPC1000全自动凝胶净化系统（莱伯泰科）：具可变波长紫外检测器，高效不锈钢凝胶净化柱；

1.1.4 MiniLab 全自动稀释配标系统（莱伯泰科）；

1.1.5 7890B 气相色谱-5977B 质谱联用仪（安捷伦）；

1.1.6 旋转蒸发仪（莱伯泰科）

1.2 试剂和标准品

1.2.1 正己烷（农残级）；

1.2.2 二氯甲烷（农残级）；

1.2.3 乙酸乙酯（农残级）；

1.2.7 无水硫酸钠（分析纯, 在300℃马弗炉中烘烤3h后冷却备用）；

1.2.8 硅藻土（粒径中位至32um, 分析纯, 在300℃马弗炉中烘烤3h后冷却备用）;

1.2.9 酚类化合物混合标准溶液: 苯酚 (Phenol )、2-氯苯酚 (2-Chlorophenol ) 、邻-甲酚 (2-Methylphenol)、对-甲酚 (4-Methylphenol) 、间-甲酚 (3-Methylphenol)、2-硝基酚 (2-Nitrophenol) 、2,4-二甲酚 (2,4-dimethyl phenol ) 、2,4-二氯酚 (2,4-Dichlorophenol) 、2,6-二氯酚( 2,6-Dichlorophenol )、4-氯-3-甲基苯酚 (4-chloro-3-methylphenol)、2,4,6-三氯苯酚 ( 2,4,6-Trichlorophenol ) 、2,4,5-三氯苯酚 ( 2,4,5-Trichlorophenol )、2,4-二硝基酚 ( 2,4-Dinitrophenol) 、4-硝基酚 (4-Nitrophenol ) 、2,3,4,6-四氯酚( 2,3,4,6-Tetrachlorophenol )、2,3,4,5-四氯酚 (2,3,4,5-Tetrachlorophenol )、2,3,5,6-四氯酚 (2,3,5,6-Tetrachlorophenol )、2-甲基-4,6-二硝基酚 (2-Methyl-4,6-dinitrophenol )、五氯苯酚 (Pentachlorophenol )、2-(1-甲基-正丙基)-4,6-二硝基酚(地乐酚) (2-sec-Butyl-4,6-dinitrophenol(Dinoseb)、 2-环己基-4,6-二硝基酚 (2-Cyclohexyl-4,6-dinitrophenol)。1 000 mg/L (Accustandard公司, 甲醇介质) , 用甲醇稀释成100.0mg/L的标准储备溶液, 于4℃冰箱中密闭避光保存;

1.3 土壤样品处理

1.3.1 提取

取研细过筛后的环境土样 10g，并保证样品含水率在15%~20%（如果土壤含水量较少，可加入适量的水调节至此范围）与适量硅藻土混合均匀，并研磨，装填至 34mL 的萃取罐中。使用高效压力萃取系统进行萃取,萃取参数如下：

系统压力 10Mpa，萃取温度 120℃，加热平衡时间 3min，萃取溶剂：二氯甲烷正己烷2:1(v/v)

静态萃取时间 6min，冲洗体积 60%，N2吹扫 60s。循环运行两次。

1.3.2 浓缩

提取液经装有无水硫酸钠的漏斗脱水，用二氯甲烷充分淋洗无水硫酸钠，合并全部有机相并置于旋转转蒸发仪中，在温度35℃，压力200mbar下，浓缩至1ml，待净化。

1.3.3 净化

使用凝胶色谱进行净化：

凝胶色谱条件：

色谱柱：Bio-Beads SX3(莱伯泰科）；

流动相：二氯甲烷；

紫外检测器波长：256nm；

流速：5mL/min；

收集时间：9min至18min；

将收集液置于旋转蒸发仪中，浓缩至1ml,上机分析。

1.4 分析仪器条件

色谱柱：HP-5ms，30m*0.25mm*0.25μm；进样口温度：280℃；进样模式：不分流；柱流速：1.0mL/min（恒流）；柱箱温度：初始温度35℃，保持4min；以15℃/min升温至150℃，保持5min；以10℃/min升温至290℃，保持9min；四极杆温度：150℃；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；扫描模式：全扫描模式:Scan

2结果与讨论

2.1 21种酚类色谱分离情况

图 1 21种酚类总离子流谱图

使用HP-5ms毛细管柱进行分离，由图1可知，除间二甲酚与对二酚外，其他酚类化合物均能较好的分离。化合物保留时间，定量和定性离子见表1

序号	化合物名称	保留时间/min	定量/定性离子
1	苯酚	8.999	94/66/65
2	2-氯酚	9.136	128/64/130
3	邻甲苯酚	9.904	108/107/79
4/5	间/对甲苯酚	10.15	107/108/77
6	2，硝基苯酚	10.862	139/63/109
7	2，4 二甲酚	10.959	122/107/121
8	2,4二氯酚	11.22	162/164/63
9	2，6二氯酚	11.589	162/164/63
10	4-氯-3甲酚	12.442	142/107/144
11	2.4.6三氯酚	13.366	196/168/200
12	2.4.5三氯酚	13.448	196/168/97
13	2,4二硝基苯酚	16.159	184/63/53
14	对硝基苯酚	16.650	139/65/109
15	2,3,4,5四氯酚	17.262	232/230/234
16	2,3,5,6四氯酚	17.363	232/230/234
17	2,3,4,6四氯酚	17.474	232/230/234
18	2-甲基4.6二硝基苯酚	18.716	198/105/121
19	五氯酚	21.21	268/266/264
20	地乐酚	22.005	211/165/147
21	环己基4，6二硝基酚	26.151	231/185/193

表1

2.2 萃取条件的选择

分别对比不同的条件进行正交实验，影响因素及水平见表2、表3

影响因素	萃取温度（A）	萃取溶剂（B）	样品含水量（C）
水平一	100℃(A1)	二氯甲烷正己烷2+1（v/v）(B1)	>1%（300摄氏度,4小时灼烧）（C1）
水平二	120℃(A2)	乙酸乙酯二氯甲烷(B2)	2%~5%（风干土壤）(C2)
水平三	——	——	15%~20% 新鲜土壤(C3)

正交实验表
实验1	实验2	实验3	实验4	实验 5	实验 6	实验7	实验8	实验9	实验10	实验11	实验12
A1B1C1	A1B1C2	A1B1C3	A1B2C1	A1B2C2	A1B2C3	A2B1C1	A2B1C2	A2B1C3	A2B2C1	A2B2C2	A2B2C3

表2

表3

正交实验结果见表4

表 4

由表4可知样品含水量对提取效率的影响较大，当样品被高温烧灼后，含水量小于1%，酚类化合物很难被充分提取，即使升高提取温度或改变提取试剂也没有明显效果，这是因为土壤被烧灼后，结合水以及其极性物质离开土壤表面，使土壤活性点完全暴露，目标物被其吸附后，难以解析。当样品含水率在2%~%5时，提取效率明显增高，但是部分化合物，如邻甲苯酚、2，4 二甲酚，等提取效率较低，这是因为化合物中的β氢受羟基氧原子中孤电子对的影响较为活泼容易与基质形成氢键。同理，部分含硝基的目标物如2,4二硝基苯酚、2-甲基4.6二硝基苯酚等因硝基的强吸电子能力的原因，也使羟基中的氢更加活泼，与基质作用力更强，难以提取。当样品含水量为15%~20%时，大部分目标物由基质吸附的状态，变为依附水层的状态，提取效率大幅度升高。所以在实验前，应调节土壤含水率。

分别对比了100℃和120℃的萃取温度下的提取效率，由表4可知，在120℃的萃取温度下部分高沸点化合物如五氯酚、地乐酚、环己基4，6二硝基酚提取效率较高，因此，选择120℃作为提取温度。

分别对比了乙酸乙酯二氯甲烷1+1（v/v ）和二氯甲烷正己烷2+1(v/v)提取效率。由表4可知在提取风干样品时,前者优于后者，但是仍不足以提高上述吸附性较强的目标物的提取效率。在萃取新鲜样品时，两者萃取效率相当，但因乙酸乙酯的极性较强会提取出更多的色素，不利于后续净化，且其沸点较高会延长浓缩时间，影响实验效率。因此本方法采用二氯甲烷正己烷2+1(v/v)作为提取试剂。

综上所述，萃取步骤方法选择实验9（A2B1C3）。

2.3净化方式的选择

分别对比，固相萃取净化，凝胶色谱净化，液液萃取净化，的回收率和净化效果，实验结果见表5

表5

由表5可知，凝胶色谱与液液萃取回收率基本相当，都略高于固相萃取的回收率。从净化效果来说，凝胶色谱与液液萃取因通过分子筛和酸碱分配的方式能够除去全部的油脂类的干扰物，和部分色素。但固相萃取的方式，因酚类极性较强，必须使用极性较强的溶剂洗脱萃取柱才能保证回收率，所以大部分干扰物无法与目标物分离，净化效果较差。

对比凝胶色谱和液液萃取，后者需要反复调节PH，采用振摇的方式进行萃取，步骤繁琐，并且因经常会出现乳化现象导致结果稳定性不高，而凝胶色谱采用自动化方式，基于色谱分离的原理，不仅操作简单，也具有良好的稳定性和重现性。因此本方法采用凝胶色谱作为净化方式。

2.4标准曲线和检出限

为考察方法检出限,配制浓度为2.50、5.00、10.0、20.0和50.0 mg/L的21种酚类化合物标准溶液(以峰面积对浓度作标准曲线) 得到各组分的线性方程、相关系数及检出限见表6

序号	化合物	线性方程	R	检出限（mg/kg）
1	苯酚	y=374594.6x+1054191.0	0.9980	0.04
2	2-氯酚	y=454159.9x+486424.1	0.9999	0.03
3	邻甲苯酚	y=274504.8x+1037621.2	0.9971	0.03
4/5	间/对甲苯酚	y=500164.2x+2202597.3	0.9986	0.02
6	2-硝基苯酚	y=248151.2x-136398.1	0.9996	0.04
7	2,4 -二甲酚	y=285574.2x+1002052.8	0.9986	0.02
8	2,4-二氯酚	y=294678.0x+922262.3	0.9974	0.02
9	2,6-二氯酚	y=295683.7x+947597.8	0.9973	0.02
10	4-氯-3-甲酚	y=282311.1x+546868.0	0.9994	0.03
11	2,4,6三氯酚	y=286951.6x+378680.7	0.9983	0.03
12	2,4,5三氯酚	y=307197.4x+372523.6	0.9988	0.03
13	2,4-二硝基苯酚	y=67400.5x-250717.8	0.9951	0.07
14	对硝基苯酚	y=18310.6x-684985.7	0.9973	0.06
15	2,3,4,5四氯酚	y=361943.0x+522455.6	0.9991	0.03
16	2,3,5,6四氯酚	y=347889.9x-313854.3	0.9996	0.03
17	2,3,4,6四氯酚	y=340670.4x-217155.5.1	0.9996	0.03
18	2 -甲基4.6二硝基苯酚	y=205003.4x-859860.8	0.9952	0.06
19	五氯酚	y=182972.3x-294480.6	0.9992	0.03
20	地乐酚	y=303031.6x-1042031.9	0.9975	0.03
21	环己基4，6二硝基酚	y=38979.3x+1759753.3	0.9952	0.05

表6

结果表明:21种酚类化合物含量2.50～50.0mg/L范围内线性良好,相关系数为0.995～0.999,检出限为0.02～0.07 mg/kg,小于方法检出限0.02～0.08mg/kg,满足土壤中酚类化合物的测定要求。

2.4回收率与精密度

测定6个加标样品的加标回收率和RSD值，加标浓度为0.5mg/kg。实验结果见表7

序号	化合物名称	6组平行样回收率/%						平均值/%	RSD/%
序号	化合物名称	1	2	3	4	5	6
1	苯酚	73.7	74.5	72.4	78.3	70.3	72.2	73.6	3.7
2	2-氯酚	70.5	76.1	72.2	79.1	77.6	71.8	74.5	4.7
3	邻甲苯酚	71.4	73.1	78.4	80.5	79.2	73.9	76.1	4.9
4/5	间/对甲苯酚	74.7	75.6	80.3	84.0	81.4	76.2	78.7	4.7
6	2-硝基苯酚	72.7	76.9	83.3	90.9	103.8	83.4	85.2	13.0
7	2,4 -二甲酚	74.4	69.9	71.3	75.3	71.4	83.4	74.3	6.6
8	2,4-二氯酚	70.1	74.3	80.6	93.2	87.9	68.4	79.1	12.6
9	2,6-二氯酚	79.8	79.0	78.7	91.0	87.6	84.3	83.4	6.1
10	4-氯-3-甲酚	73.8	75.0	88.5	98.6	89.7	82.6	84.7	11.2
11	2,4,6三氯酚	79.3	77.3	91.7	97.1	96.9	87.0	88.2	9.7
12	2,4,5三氯酚	77.5	83.6	101.5	99.4	103.6	102.6	94.7	11.8
13	2,4-二硝基苯酚	79.8	83.3	76.1	75.7	78.5	104.9	83.1	13.3
14	对硝基苯酚	72.3	72.9	73.3	80.9	93.8	105.8	83.2	16.6
15	2,3,4,5四氯酚	75.4	75.9	85.4	76.9	71.6	86.2	78.6	7.5
16	2,3,5,6四氯酚	82.1	83.2	88.9	72.4	79.8	75.4	80.3	7.3
17	2,3,4,6四氯酚	76.5	81.8	88.1	74.8	77.7	82.3	80.2	6.1
18	2 -甲基4.6二硝基苯酚	76.5	86.8	90.8	101.2	107.2	96.7	93.2	11.7
19	五氯酚	92.1	97.3	89.0	85.6	94.2	93.2	91.9	4.5
20	地乐酚	87.4	84.9	82.4	84.0	76.3	89.6	84.1	5.5
21	环己基4，6二硝基酚	95.5	92.8	112.7	102.9	90.8	112.3	101.2	9.6

表7

由表7可知,21种酚类化合物加标回收率平均值为73.6%～101.2%，相对标准偏差为3.7%～16.6%。低于国家标准方法要求相对标准偏差1.6%～24.4%，满足土壤中酚类化合物的测定要求。

3．结论

本文建立了加速溶剂萃取，凝胶色谱净化土壤中21种酚类化合物的方法, 并采用气相色谱-质谱法进行了测定。试验通过对溶剂的选择、萃取温度的调节，以及对土壤样品含水量的控制，提高了目标物的提取效率。并通过比较实验确定了凝胶色谱的净化方式。本方法全程使用自动化仪器，高效、快捷，对实验人员伤害小，并且有良好的稳定性与准确性，适用于土壤中酚类的检测。

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