主题：【资料】蛋白过镍柱纯化的科学原理及详细步骤

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发表于：2023/11/01 16:42:12 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

蛋白过镍柱纯化的原理是利用Ni柱中的氯化镍与有HIs（组蛋白）标签的蛋白特异性结合的能力，同时也能与咪唑结合。具体步骤如下：

①过柱子前可以选择Ni柱重生，往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行，然后平衡柱子，用你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境。

②平衡4个柱长后，蛋白上样，可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些。如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差。也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。

③挂完之后，按理想来讲，蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里留下来了。肯定有少量杂蛋白也挂上了。这时候要梯度洗脱，拿咪唑和你的buffer配，一般从0、20mM、40mM......100mM这样洗脱。咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来。

④洗完之后，可以用200mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次。是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~ 过的蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。

以上步骤仅供参考，不同的实验条件可能方法会不同。具体可以查阅专业书籍或者咨询专业人士。

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