主题：【分享】【金秋计划】如何利用同位素提高线性上限

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发表于：2024/09/12 09:48:59 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

液相色谱/质谱法（LC/MS）由于能够在一次分析中检测出多种化合物，已迅速成为一般实验室的首选分析方法。然而，LC/MS 的主要局限之一是：定量的线性动态范围相对有限。

解决这一问题的新方法是使用 [+1M+H]+ 同位素质量峰进行定量，从而降低检测器的饱和度，扩大线性范围。这在全扫描应用中特别有用，例如四极杆飞行时间质谱法（QTOF），在这种方法中，同位素质量峰的获得是理所当然的。

由于常见元素（尤其是 13C）的天然同位素丰度存在差异，这种技术有可能导致额外的定量误差。

通过回顾已发表的同位素比质谱数据，我们对这种潜在误差进行了评估，发现误差可能小于 2%，不太可能超过 4%，不过这可能不适用于含有大量氮或硫原子的化合物。在使用该技术之前，必须考虑到这一额外的潜在误差，因为它可能不适合所有应用。我们认为该技术适用于我们的应用，并展示了该技术在 LC-TOF 定量方法中的适用性。

引言

液相色谱法和质谱法的最新进展大大增加了单次分析可检测和定量的化合物数量。全扫描高分辨率 LC-MS 仪器尤其如此，至少从理论上讲，它可以将无限数量的化合物纳入筛选方法。然而，LC/MS 仪器的线性动态范围相对有限，这意味着当测量浓度超过线性上限时，样品往往需要稀释并重新分析。

这在多化合物分析方法中尤其成问题，因为在多化合物分析方法中，分析物之间的理想浓度范围可能会跨越几个数量级。在现代液相色谱/质谱仪中，高浓度非线性的原因通常是检测器饱和。

对于使用三重四极杆 MS/MS 针对特定化合物的方法，可以通过改变每种化合物的 MS 参数来有意降低灵敏度，或针对不同的校准范围或化合物同时使用高灵敏度和低灵敏度的离子对或检测极性，在一定程度上克服这一问题。

在获取全扫描高分辨率质谱数据的广泛筛选方法中，通常无法修改单个化合物的采集参数以降低灵敏度，从而在不影响其他分析物检测的情况下提高线性范围。为了在相关浓度下对低含量或低响应化合物保持足够的灵敏度，可能会采用提供最高灵敏度的参数，这可能会影响较高浓度下的线性范围。

Lui 等人最近提出的一项技术是：使用含量较低的同位素来增加线性动态范围。通过在 QQQ 的 Q1 和 Q3 的 MRM 离子对中加 1，或从 QTOF 的全扫描数据中选择一种替代的同位素，他们减少了到达检测器的离子数量。

这项技术在全扫描高分辨率仪器（如 QTOF）上的应用前景最为广阔，因为所有同位素数据的采集都是理所当然的，无需修改数据采集方法，也不会影响周期时间--只需在采集后更改数据处理即可。此后，分析领域的少数学者都采用了这种技术，以降低检测器的饱和度，达到定性和定量分析的目的。

这种方法在用于定量分析时的一个潜在局限性是，如果样本中的分析物与用于校准的参考标准品的来源不同（在一般实验室中通常是这种情况），它可能不包含相同比例的同位素。事实上，使用不同合成途径生产的药品可能会出现同位素差异。这种差异可能会导致计算浓度出现误差。迄今为止，文献中似乎很少考虑这种可能性。

我们利用一种含量较低的同位素，对这种差异对具有重要法医意义的药物定量可能产生的影响进行了研究。为了说明这种方法，我们简要介绍了将这种技术应用于使用 LC-QTOF 对全血中基本药物进行定量的常规方法。

样品提取处理与仪器

样本为血液样本，经蛋白沉淀，蒸发浓缩后，在乙醇中复溶。仪器为液相色谱-电喷雾电离质谱 (LC-ESI-MS)和 GC-C-IRMS（用于测定碳同位素比值）

结果与讨论

稳定同位素比率
一般实验室分析的大多数化合物只含有少数几种元素，即碳 (C)、氢 (H)、氮 (N)、氧 (O) 和硫 (S)。其中每种元素都有一种天然存在的同位素，带有一个额外的中子（此处称为+1A）。这些元素的丰度见表 1。在一般的分析中，化合物中较少发现的元素包括磷 (P)、氯 (Cl)、氟(F)、碘 (I)和溴 (Br)，所有这些元素都没有天然存在的 +1 同位素。

表 1.天然存在的稳定同位素的丰度
元素 +1A 自然丰度 (%)
氢 2H 0.0115
碳 13C 1.07
氮 15N 0.364
氧 17O 0.038
硫 33S 0.75

一般实验室使用的典型质谱仪很容易分辨出含有额外中子的分子，但它们没有足够的分辨能力来指示额外中子在分子中所处的位置。
例如，含有一个 13C 原子的化合物无法与含有一个 2H 原子的化合物区分开来。因此，所有 +1 同位素都会被检测为一个信号，在此定义为 [+1M+H]+ 质量峰。

根据表 1 中给出的天然同位素丰度，可以很容易地确定这些同位素对任何相关化合物[+1M+H]+ 质量峰的相对贡献。
图 1 显示了一些常见药物的 [+1M+H]+ 质量峰的组成。显然，这些药物（以及大多数其他药物）的 [+1M+H]+ 质量峰的最大贡献来自 13C 同素异形体。

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