主题：【分享】苦豆碱直接靶向VPS4A调控自噬抑制肺癌进展

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发表于：2024/09/12 17:19:54 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

苦豆碱（Aloperine，ALO）是从苦豆子（Sophora alopecuroides L.）种子和叶中分离出来的一种喹诺里西啶型生物碱，据报道，它对多种类型的癌症表现出强大的抗肿瘤作用，包括结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞和甲状腺癌细胞。已发现的机制主要包括诱导细胞凋亡、抑制侵袭和抑制自噬，表明这些过程起着至关重要的作用。然而，ALO对非小细胞肺癌（NSCLC）的抗肿瘤作用的分子机制及其在NSCLC细胞中的特定分子靶点仍然很大程度上未知。

2024年6月21日，华中科技大学同济医学院附属协和医院胡德胜教授团队在Advanced Science（IF=14.3）发表题为“Aloperine Suppresses Cancer Progression by Interacting with VPS4A to Inhibit Autophagosome-lysosome Fusion in NSCLC”的文章，发现ALO在体外和体内对NSCLC有良好的抗肿瘤作用，ALO诱导的细胞毒性是由于其抑制自噬的能力。从机制上讲，ALO直接结合并抑制VPS4A，诱导自噬体未封闭，抑制自噬体与溶酶体的融合，从而抑制伴随SQSTM1积累的自噬通量，升高的SQSTM1水平诱导ROS产生，随后引发NSCLC细胞凋亡。SQSTM1敲低消除了ALO诱导的ROS积累和细胞毒性。这些发现表明ALO是一种新型的晚期自噬抑制剂，可通过靶向VPS4A来触发肿瘤细胞死亡。

1、ALO抑制NSCLC细胞系的增殖和迁移

为了评估ALO对体外NSCLC细胞的细胞毒性和抑制作用，作者用ALO处理人NSCLC细胞系H1299和小鼠NSCLC细胞系LLC细胞，发现ALO抑制H1299和LLC细胞的生长，增殖、诱导细胞周期停滞，并通过抑制EMT过程来抑制体外细胞迁移和侵袭

2、ALO在体内发挥抗肿瘤作用

为了评估ALO是否对体内NSCLC肿瘤生长有治疗作用，将H1299和LLC细胞分别注射到BALB/c裸鼠和C57BL/6小鼠皮下，建立皮下肿瘤模型。发现ALO显著抑制了H1299和LLC衍生的皮下肿瘤生长。此外，ALO显著抑制了Kras G12D ; Trp53 fl/fl突变肺腺癌小鼠肿瘤生长，且无明显的副作用。

3、鉴定ALO作为自噬调节剂

进一步研究ALO的抗NSCLC分子机制，通过RNA-seq确定ALO治疗和未治疗的NSCLC细胞之间差异表达的基因，KEGG分析显示细胞周期通路富集，此外，ALO处理后自噬通路和相关基因富集，表明ALO可能调节自噬。接着作者使用透射电子显微镜在用 ALO 处理的细胞中观察到自噬囊泡（自噬溶酶体和自噬体）数量增加。LC3和SQSTM1水平被广泛用作自噬的生物标志物，作者通过WB显示ALO增加了 LC3B-II/β-Actin的比率和SQSTM1的水平，表明ALO处理增强了自噬体的积累。

4、ALO作为晚期自噬抑制剂发挥作用

已证实ALO能促进自噬体的积聚。然而，ALO是诱导自噬体的产生还是抑制自噬体的降解还有待进一步研究。为了区分这两种可能性，在SAR405或ATG7 siRNA（通过抑制自噬体形成来抑制早期自噬）或bafilomycin A1（BafA1）（通过损害溶酶体降解来抑制晚期自噬）的存在下用ALO处理NSCLC细胞，然后通过免疫印迹分析自噬通量。作者发现证实ALO抑制自噬体的降解。SQSTM1是一种选择性自噬受体，在自噬过程中被募集到吞噬细胞并被组成性降解。因此，SQSTM1通常用于间接反映细胞内的自噬通量。作者发现在用ALO处理细胞后，SQSTM1水平显著上调，这表明ALO可能抑制自噬通量。此外，免疫荧光同样证实ALO是一种晚期自噬抑制剂，且ALO抑制自噬体与溶酶体的融合。

5、ALO介导的SQSTM1积累引发ROS产生和细胞凋亡

鉴于ALO被认定为晚期自噬抑制剂，作者ALO是否通过自噬诱导NSCLC细胞的细胞毒性。发现ALO给药诱导H1299和LLC细胞中的LDH释放，证实ALO会诱导NSCLC细胞的细胞毒性。自噬抑制剂SAR405不能阻断ALO处理引起的细胞死亡，凋亡抑制剂Z-VAD-FMK，而不是铁死亡抑制剂（ferrostatin-1）或坏死性凋亡抑制剂（necrostatin），可以阻断ALO处理引起的细胞死亡。进一步流式细胞证实了ALO诱导NSCLC细胞凋亡。前面发现ALO抑制自噬通量，导致SQSTM1水平升高。考虑到据报道SQSTM1的积累会导致ROS生成，而过量的ROS促进细胞凋亡，作者推测并验证了ALO诱导的细胞凋亡是由SQSTM1积累介导的过量ROS生成触发的。

6、VPS4A被确定为ALO的直接靶标

为了确定ALO发挥抗肿瘤作用的靶蛋白，作者采用DARTS+MS技术确定了ALO的直接靶点，发现ef1a1、ef1a2、VPS4A三个候选蛋白，免疫印迹确定VPS4A是ALO的潜在靶点，并进一步通过CETSA、SPR证实了ALO与VPS4A的结合。VPS4A是ESCRT正常功能所必需的，而EGFR的降解需要ESCRT复合物，作者发现在ALO处理的H1299细胞中EGFR水平显著升高，这进一步证明VPS4A是ALO的细胞靶点。接着作者通过分子对接结合蛋白点突变实验确定ALO在VPS4A中的特定结合位点，证实 VPS4A 的F153和D263是ALO的结合位点，DARTS和CETSA证实野生型WT，而非突变型VPS4A能和ALO结合。

7、ALO通过靶向VPS4A诱导SQSTM1积累

据报道，VPS4A的功能障碍与自噬体未封闭有关，这可能通过阻止STX17募集到自噬体膜上来抑制自噬体与溶酶体的融合。作者发现ALO处理和敲除VPS4A均导致 LC3点与STX17明显分离，表明ALO通过靶向VPS4A诱导自噬体未封闭。随后，将WT或突变 VPS4A的质粒导入H1299细胞确定ALO对细胞自噬的影响，证实了ALO通过与VPS4A的F153和D263位点结合来调节自噬过程。进一步体内实验结果同样表明ALO通过靶向VPS4A对体内NSCLC肿瘤生长发挥治疗作用。总之，ALO通过靶向VPS4A诱导未封闭的自噬体形成，从而抑制自噬体与溶酶体的融合，导致SQSTM1积累和ROS水平的升高，最终引发细胞凋亡的发生。

8、ALO增强NK细胞的细胞毒性和双特异性抗体在肿瘤治疗中的功效

据报道，ESCRT抑制可增加癌细胞对细胞毒性淋巴细胞的敏感性，并提高癌细胞内颗粒酶B的水平。作者发现ALO增强了人类自然杀伤细胞系NK-92MI细胞对靶细胞的细胞毒性。进一步探讨ALO对体内NK细胞细胞毒活性的调节作用，发现给予ALO后，肿瘤和脾脏中颗粒酶B+NK细胞和穿孔素+NK细胞的百分比显著增加。YM101是一种阻断TGF-β和PD-L1的双特异性抗体，在癌症中表现出强大的抗肿瘤活性。作者发现在LLC衍生的皮下肿瘤小鼠模型中，ALO和YM101组合的疗效明显高于ALO或YM101单药治疗，这些结果表明，ALO和免疫疗法的结合可能代表一种有前途的NSCLC治疗策略。

总结

该研究将ALO鉴定为一种新型的晚期自噬抑制剂，并从体外和体内分析证实了这一点。从机制上讲，ALO与VPS4A的F153和D263氨基酸互作，导致未封闭的自噬体形成，从而抑制自噬体和溶酶体的融合。此外，ALO介导的自噬通量阻断会诱导SQSTM1的积累，从而促进过量的ROS产生，导致NSCLC细胞凋亡。总之，本研究将 ALO 鉴定为一种新型的晚期自噬抑制剂，可通过靶向VPS4A 来触发 NSCLC 细胞凋亡。