主题：【分享】整合代谢组学和网络药理学探究蕲艾的安全性与毒理学机制

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发表于：2024/09/13 22:10:59 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

中药被公认为是绿色、安全、高效的药物来源，近年来随着中医药在世界范围内的认可度不断提高，其安全性越来越受到重视。艾叶作为我国大宗中药材，具有温经通络、止血、抗过敏、抗肿瘤、抗炎、抗菌等诸多功效，在食品领域作为茶饮和小吃也极为常见[1-3]。然而，临床上曾有艾叶使用不当导致中毒、引起黄疸性肝炎及急性肝损伤等案例，导致艾叶安全性饱受争议[4]。实际上，历代本草著作中对艾叶安全性均有记载，追溯至最早的《名医别录》，到《新修本草》《食疗本草》《食物本草》《本草纲目》等多部典籍均直接注明无毒[5]；《图经本草》载其“有毒，其毒发则热气冲上，狂躁不能禁”[6]；《中国药典》自1963年版收载艾叶未注明有毒，1977年版及其后将其列为“小毒”。虽然，已有部分实验研究在使用剂量远高于《中国药典》规定人等效剂量下探究了艾叶挥发油的急性肝毒性，但由于不太符合应用实际情况，参考价值有限，而且具体毒性成分尚未解析[7-8]。此外，艾叶水溶性、醇溶性成分的毒性仍不明确。重要的是，之前研究均未对历代医家推崇的“蕲艾”进行安全性评价，蕲艾是否和其他艾叶毒性有区别，亟待考察。
代谢组学可从整体代谢的角度详尽而具体地概述生物体涉及病理或毒理学事件的内源性代谢状态，从而为识别药物的毒理学机制提供有价值的证据，这与中医药的整体思维较一致[9]。网络药理学通过构建疾病-靶点-药物相互作用网络，可以其全局性和系统性的研究优势为中药毒理学机制的研究提供新的概念[10]。基于此，本研究以湖北道地药材蕲艾为研究对象，采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography coupled to tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）全面解析蕲艾挥发性和非挥发性组分的化学成分，利用KM小鼠连续7 d ig给予蕲艾挥发性和非挥发性组分评价各组分的安全性，并以1H-NMR代谢组学技术阐明毒性组分对内源性代谢物的影响机制。最后，整合网络药理学建立药物-成分-疾病-靶点网络和代谢-反应-酶-基因相互作用网络，系统阐述蕲艾毒性物质和作用机制，以期为蕲艾的临床安全应用提供理论基础。
1 材料
1.1 动物
SPF级KM小鼠132只，雌雄各半，体质量18～20 g，购自湖北省疾病预防控制中心，许可证号SCXK（鄂）2020-0018。动物饲养于湖北中医药大学实验动物中心，温度23～25 ℃，相对湿度45%～55%，光照12 h，自由进食饮水。动物实验经湖北中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号HUCMS44453574）。
1.2 药材
蕲艾采自湖北省黄冈市蕲春县，经湖北中医药大学刘大会教授鉴定为蕲艾Artemisiaargyi Lévl. et Vant. var. argyi 'Qiai'。
1.3 药品与试剂
乙醇、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇购自中国医药集团化学试剂有限公司，均为分析纯；色谱级甲醇、乙腈、甲酸购自德国默克公司；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒（批号20211128）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒（批号20211128）、尿素氮（urea nitrogen，BUN）试剂盒（批号20211205）、肌酐（creatinine，CRE）试剂盒（批号20211205）购自南京建成生物科技有限公司；实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒（批号U8227）购自天根生化科技有限公司；苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）抗体（批号A20949）购自Abclonal公司。
1.4 仪器
Trace 1310型气相质谱联用仪、TG-1701MS型毛细管柱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Waters Acquity I-Class UPLC超高效液相色谱仪串联Waters Xevo G2-S飞行时间质谱仪（美国Waters公司）；BC-5000VET型全自动动物血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；Avance Ⅲ 500 MHz型核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；5804 R型离心机（德国Eppendorf公司）；Synergy 2型酶标仪（美国Bio-Tek公司）。
2 方法
2.1 蕲艾挥发油（essential oil from A. argyi，AAEO）及非挥发性组分的制备
参照《中国药典》2020年版四部通则2204“挥发油测定法”提取AAEO[11]。取200 g干燥蕲艾，分别用8、6、6倍体积的60%乙醇室温超声提取3次，每次1 h，滤过，合并滤液后减压浓缩至无醇味，并依次用等体积的石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取3次，真空干燥得到蕲艾石油醚组分（petroleum ether fraction from A. argyi，AAPE）、醋酸乙酯组分（ethyl acetate fraction from A. argyi，AAEA）、正丁醇组分（n-butanol fraction from A. argyi，AABU）和水组分（water fraction from A. argyi AAWE）的固体粉末1.28、6.57、2.48、5.55 g。
2.2 AAEO及蕲艾非挥发性组分的化学组成分析
参考陈昌婕等[12]GC-MS方法进行挥发油组分测定，并运用Mainlib谱库对GC-MS分析得到的挥发油总离子流图中的各个色谱峰进行检索。蕲艾不同组分提取物的化学组成分析采用本课题组优化的UPLC-Q-TOF-MS方法[13]。
2.3 动物分组与给药
按照《中国药典》2020年版规定剂量计算，小鼠适应性喂养7 d后，按体质量随机分为对照组，AAEO低、高剂量（0.20、0.40 g/kg）组，AAWE低、高剂量（1.17、4.68 g/kg）组，AABU低、高剂量（1.17、4.68 g/kg）组，AAEA低、高剂量（1.17、4.68 g/kg）组和AAPE低、高剂量（1.17、4.68 g/kg）组，各给药组剂量均以相同生药量计，每组12只。小鼠连续给药7 d，给药期间每日记录各组小鼠体质量并观察小鼠形态变化，解剖后称定小鼠心、肝、脾、肺、肾的质量，计算其脏器指数。
2.4 肝、肾毒性生化指标及血常规检测与组织病理学观察
眼眶取血后，4 ℃、12 000×g离心10 min，取血浆样品备用。根据试剂盒说明书采用酶标仪检测血浆ALT、AST活性和CRE、BUN含量，采用全自动动物血液细胞分析仪检测血常规。取4%多聚甲醛中固定好的肝、心、脾、肺、肾组织，经包埋、切片、苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后置于光学显微镜下观察。
2.5 代谢组样品制备及核磁共振（NMR）检测
取对照组和AAEO高剂量组肝组织进行1H-NMR检测，用50%乙腈（5 mL/g组织）匀浆，4 ℃、12 000×g涡旋离心10 min，收集上清液，真空冷冻干燥浓缩。用0.55 mL D2O磷酸盐缓冲液（pH 7.4，含0.05% TSP，用于零点校准）复溶干燥的组织提取物，4 ℃、12 000×g涡旋离心10 min，取上清液，移入5 mm NMR管中上机测试。
使用Bruker Avance 500 MHz核磁谱仪，采用横向松弛编辑的Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)脉冲序列（RD-90°-(τ-180°-τ) n-ACQ），自旋回波延迟 (2nτ) 为40 ms。在64 K数据点采集64个自由感应衰减曲线（FIDs），谱宽20，弛缓延迟为3.0 s。
2.6 多元统计分析与代谢物鉴定
使用Topspin 3.0软件（德国Bruker公司）对原始光谱进行相位、基线校正，并以TSP的峰作为参照（δ 0.00）对齐零点。用MestReNova 14.0软件（Mestrelab，India）对核磁共振谱进行去噪、归一化处理后，用Simca-P 14.0软件（Umetrics，Sweden）导出到ACSII文件中进行主成分分析（principal components analysis，PCA）和偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）。
使用Chenomx NMR软件和查询公共数据库HMDB（http://www.hmdb.ca/）鉴定代谢物。根据积分面积计算代谢物的差异倍数（fold change，FC）和P值，使用MetaboAnalyst（http://www. metaboanalyst.ca）进行代谢通路富集分析。
2.7 网络药理学分析AAEO肝毒性
以GC-MS解析的AAEO化学成分为基础，根据SwissADME平台（http://www.swissadme.ch/ index.php）中肠胃吸收为“High”和类药性2项及以上为“Yes”筛选潜在的肝毒性成分。将符合条件的化合物“SDF”格式结构文件上传至Pharmmapper数据库（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）获取化学成分靶点（Norm Fit≥0.5），以“Hepatotoxicity”为关键词检索Genecards数据库（https://www.genecards.org/）和OMIM数据库（https://omim.org/）获取肝毒性相关靶点，将二者取交集即得潜在的毒性靶标。采用Cytoscape 3.9.1软件构建“药物-成分-疾病-靶点”多层次网络并进行拓扑学分析确定AAEO毒性成分。最后，利用David数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对交集靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。
2.8 分子对接
以ChemOffice 2019绘制毒性成分的3D结构，关键靶点的晶体结构从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）获取，并经Pymol软件去水、加氢。采用Autodock vina 1.1.2对毒性成分和关键靶点进行分子对接，通过Pymol对结合能低的对接结果进行可视化。
2.9 关键靶点验证
取对照组和AAEO高、低剂量组肝组织，按照试剂盒说明书提取组织总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列由擎科生物合成，PAH引物序列为F: 5’-CCGTTCGCTATGACCCCTAC-3’，R: 5’-CAGGGCATGGCAAAGGATTC-3’；β-actin引物序列为F: 5’-GCTGACAGGATGCAGAAGG-3’，R: 5’-TGGAAGGTGGACAGTGAGG-3’。基因表达水平采用β-actin进行归一化。取4%多聚甲醛固定的对照组和AAEO高、低剂量组肝组织，经脱水、包埋、切片、免疫组化染色后检测肝脏组织中PAH的表达[14]。
2.10 统计学分析
采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计分析，所有计量数据均以表示，组间差异采用单因素方差分析。
3 结果
3.1 GC-MS分析AAEO的化学组成
采用GC-MS对AAEO的化学组成进行分析，通过谱库检索并结合相关文献对各色谱峰进行定性分析（图1）[12,15]，采用峰面积归一化法得到各成分的相对含量（表1）。结果显示，共鉴定出39个化合物，包含16个单萜类化合物、9个醇类化合物、6个倍半萜类化合物、6个酮类化合物、1个醛类化合物以及1个酯类化合物，占AAEO含量的89.30%。其中含量最高的为1,8-桉叶素（13.35%），其次主要为侧柏酮（8.30%）、β-石竹烯（6.64%）、龙脑（5.12%）、樟脑（4.35%）、蒿醇（3.77%）、4-萜烯醇（3.65%）、γ-松油烯（3.48%）等。
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3.2 UPLC-Q-TOF-MS分析蕲艾非挥发性组分的化学组成
采用UPLC-Q-TOF-MS在负离子模式下分析AAPE、AAEA、AABU和AAWE 4个非挥发性组分的化学组成，总离子流图如图2所示。根据保留时间、准分子离子峰（[M－H]?）、主要碎片离子并参考文献数据[16-17]，初步鉴定了34个化合物（表2）。结果显示，在AAPE中鉴定出11个化合物，分别为木犀草素、咖啡酸乙酯、3-O-甲基槲皮素、茵陈色原酮、芹菜素、高车前素、矢车菊黄素、泽兰黄醇、蓟黄素、异泽兰黄素、紫花牡荆素，主要为黄酮类成分；在AAEA中共鉴定出26个化合物，包括绿原酸、咖啡酸、异绿原酸同分异构体等酚酸类成分和夏佛塔苷、木犀草素、甲基槲皮素、芹菜素、异泽兰黄素等黄酮类成分；在AABU中共鉴定出16个化合物，包括奎宁酸、绿原酸、芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷、夏佛塔苷、芹菜素-6,8-二-C-吡喃木糖苷、异绿原酸A、B、C等，主要为酚酸类和黄酮苷类化合物；AAWE中成分较少。
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3.3 AAEO及蕲艾非挥发性组分对小鼠体质量和脏器指数的影响
在实验期间，近距离观察给予各蕲艾提取组分组和对照组小鼠的一般外观和身体状况，包括运动、警觉度，以及毛发、鼻子、眼睛和四肢的外观，未见明显差异。如图3所示，与对照组比较，各给药组小鼠体质量无明显变化；AAEO低、高剂量组小鼠的肝脏指数相较于对照组均显著升高（P＜0.05、0.01），其余组别无明显差异；各组小鼠心、脾、肺、肾脏指数无明显差异，上述结果提示AAEO可能造成了肝脏损伤。
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3.4 AAEO对小鼠肝、肾毒性生化指标及血常规和组织病理学的影响
ALT、AST活性是检测肝功能正常与否的关键评价指标[18]。如图4-A、B所示，与对照组比较，给予AAEO的小鼠肝组织中ALT和AST活性呈剂量相关性升高，在0.4 g/kg剂量下具有统计学差异（P＜0.01），而蕲艾4个非挥发性组分均无显著变化。此外，进一步检测CRE、BUN水平评价药物对肾功能的影响。如图4-C、D所示，对照组与蕲艾各给药组间均无显著差异。综上，蕲艾提取组分中挥发油可造成明显的肝损伤，肝功能发生紊乱，非挥发性组分均无明显肝、肾毒性。进一步采用血常规检测考察了口服AAEO后的血液学变化。如表3所示，血常规各项指标均在本实验室正常值范围内，AAEO处理组小鼠的白细胞数、中性粒细胞数和淋巴细胞较对照组显著升高（P＜0.05、0.01）。该结果表明口服AAEO引起了小鼠血液学改变。
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将对照组与AAEO高、低剂量组小鼠肝、心、脾、肺、肾组织进行HE染色观察对组织病理学的影响（图5），结果显示对照组小鼠肝细胞索排列规则，肝小叶结构正常，肝窦无扩张、淤血。AAEO高、低剂量组肝组织严重损伤，细胞质溶解、疏松，肝细胞变形、间隙增大；而心、脾、肺和肾组织与对照组相比均无明显变化。该结果从组织病理学角度证实了AAEO的肝毒性损伤。
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3.5 小鼠肝组织1H-NMR图谱及差异代谢物分析
AAEO高剂量组和对照组肝组织的500 MHz 1HNMR谱图见图6-A，根据化学位移、耦合常数等信息并结合数据库共指认了34个内源性代谢物。使用R软件对归一化后的峰面积数据进行PCA和PLS-DA。PCA得分图显示AAEO高剂量组与对照组有明显的分离趋势（图6-B），表明AAEO引起了小鼠肝组织的代谢紊乱。
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为进一步明确代谢物的差异，采用有监督的PLS-DA筛选差异代谢物，运用2折交叉验证法检验模型有效（图6-C）。计算各化合物的积分面积，进行组间比较得出FC值，结合t检验明确差异表达代谢物。肝组织代谢物FC及P值见表4，与对照组相比，AAEO组肝脏中共有17个代谢物发生了显著改变，主要以氨基酸为主，其中亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、肌氨酸、酪氨酸在AAEO处理后含量显著下调，苯丙氨酸含量显著上调。MetaboAnalyst通路富集显示AAEO显著影响苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（?lgP＝2.59，impact factor＝1.00）；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（?lgP＝6.06，impact factor＝0.40）；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢（?lgP＝2.20，impact factor＝0.50）；乙醛酸和二羧酸代谢（?lgP＝4.45，impact factor＝0.14）及谷胱甘肽代谢（?lgP＝1.70，impact factor＝0.36）等代谢通路（图6-D）。
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3.6 AAEO肝毒性的网络药理学分析
采用网络药理学分析AAEO引起肝损伤的作用机制，经SwisAMDE筛选肠胃吸收和类药性后保留20个成分。通过Pharmmapper数据库获取成分靶点共计150个，利用Genecards和OMIM数据库筛选出肝毒性相关靶点912个，将二者取交集得AAEO产生肝毒性的潜在靶点49个。利用Cytoscape 3.9.1软件构建“药物-成分-疾病-靶点”网络（图7），网络中共包含71个节点（1个药物节点、1个疾病节点、20个活性成分节点、49个潜在靶点）和414条边。利用“Network analyze”工具对网络进行拓扑分析，筛选出前10位成分度值均大于15，为潜在的毒性成分，分别是龙脑乙酸酯（度值＝40）、cis-chrysanthenol（度值＝34）、龙脑（度值＝34）、1,8-桉叶素（度值＝32）、石竹烯（度值＝28）、菊油环酮（度值＝25）、樟脑（度值＝23）、侧柏酮（度值＝18）、(?)-宁酮（度值＝18）、4-侧柏醇（度值＝17），上述结果表明AAEO由多成分、多靶点引起肝毒性。
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3.7 代谢组学与网络药理学整合分析
通过将代谢组学筛选的17种差异代谢物导入Cytoscape 3.9.1软件，利用Metscape插件构建“代谢物-反应-酶-基因”网络共获得差异代谢物相关靶点194个。随后，将网络药理学确定的49个潜在靶点与194个差异代谢物相关靶点相交，确定了1个关键靶点，即PAH（图8）。PAH又称苯丙氨酸-4-单加氧酶，为催化苯丙氨酸生成酪氨酸的关键酶[19]，结合代谢组学结果中AAEO处理后小鼠肝脏中苯丙氨酸显著上调，酪氨酸显著下调，表明AAEO可作用于PAH抑制酪氨酸的生物合成进而产生肝毒性（图9）。
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3.8 分子对接
选取基于网络药理学筛选出的10个潜在毒性成分与PAH（PDB ID：1DMW）进行分子对接，其结合能数据见图10。配体与受体的结合越稳定，其结合能越低。本研究中10个化合物与PAH的结合能均＜?20.00 kJ/mol，其中较为突出的包括石竹素、(?)-宁酮、龙脑乙酸酯、菊油环酮、侧柏酮和4-侧柏醇（结合能＜?25.00 kJ/mol），部分结合构象见图11，该结果表明它们可能是AAEO中关键的肝毒性成分。
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3.9 关键靶点验证
为充分证实AAEO可作用于PAH抑制酪氨酸的生物合成进而产生肝毒性，采用qRT-PCR和免疫组化法测定对照组和AAEO高、低剂量组肝组织中的PAH表达，如图12-A所示，AAEO可呈剂量相关性地抑制肝组织中PAH mRNA表达（P＜0.05、0.01）。免疫组化结果表明，AAEO高、低剂量组肝组织中PAH蛋白表达阳性区域大小及强度较对照组显著减小（图12-B）。
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4 讨论
艾叶为我国传统民俗植物和著名中药材，应用历史悠久，蕲艾被誉为“四大名艾”之一。现存最早医书《五十二病方》就载有使用艾叶治病的方子，现代药理学研究表明艾叶口服使用具有抗菌、止血、抗炎、止痛、止咳平喘、抗肿瘤、降血糖、免疫调节等多种药理作用，可见艾叶是保障人类生命健康的重要药物[20]。然而，由于部分本草著作和一些文献报道其毒性，严重阻碍了其开发利用。因此，本研究以蕲艾为研究对象，为弄清其毒性组分、毒性成分及毒性机制，采用GC-MS和UPLC-Q-TOF-MS解析了AAEO和蕲艾4个非挥发性组分的化学组成，研究了各化学组分对小鼠的毒性，并利用代谢组学、网络药理学、分子对接等方法阐明了AAEO肝毒性的潜在成分和机制。
AAEO和蕲艾非挥发性组分的化学组成与前人报道基本一致[12,21]，证实该材料用于艾叶毒性评价的可靠性。本研究结果显示，AAEO可显著增加肝脏指数，上调肝脏ALT和AST的活性并损伤肝脏组织病理结构，4个非挥发性组分则未表现出明显异常，表明AAEO是蕲艾的毒性组分且主要引起肝毒性。利用网络药理学构建“药物-成分-疾病-靶点”网络和分子对接技术筛选毒性或活性成分已成为阐明中药毒/药效物质基础的重要策略。通过构建蕲艾挥发油中经SwissADME检验的20个化合物肝毒性的“药物-成分-疾病-靶点”网络，筛选出10个度值大于15的成分作为AAEO潜在的毒性物质，并利用分子对接进行了验证，分别为龙脑乙酸酯、cis-chrysanthenol、龙脑、1,8-桉叶素、石竹烯、菊油环酮、樟脑、侧柏酮、(?)-宁酮、4-侧柏醇。其中，樟脑、侧柏酮是目前艾叶中公认且经研究证实具有肝毒性的2种成分，且还可引起中枢神经毒性、胚胎毒性[22]；PubChem数据库将(?)-宁酮归属为刺激性物质，石竹素为刺激性且具环境危害类物质；此外，Daniyan等[23]将Dennettia tripetala精油的肝毒性部分归因于石竹素。然而，上述物质与AAEO肝毒性的“量-时-毒”关系仍需进一步深入探究。
本研究利用代谢组学结合网络药理学的方法，旨在从整体水平上以中药“多成分、多靶点、多途径”的角度详尽阐述AAEO的肝毒性机制（图13）。肝脏是氨基酸代谢的重要器官，代谢组学研究结果显示给予AAEO后肝脏组织中17个内源性代谢物水平发生显著变化，其中包含9种氨基酸。苯丙氨酸是人体必需的芳香族氨基酸之一，由PAH催化合成酪氨酸[19]。AAEO上调苯丙氨酸水平，下调酪氨酸水平，且PAH为代谢组学与网络药理学分析筛选出的关键靶点，PAH mRNA和蛋白表达水平经实验证实在AAEO高、低剂量组均显著降低，揭示AAEO可通过下调PAH表达抑制酪氨酸生物合成途径引起肝毒性。重要的是，PAH缺乏会导致体内苯丙氨酸大量积累，引起一系列疾病，如不可逆的智力障碍、癫痫等[24]。另一方面，三羧酸循环的关键中间产物延胡索酸由酪氨酸代谢产生，在AAEO处理后含量显著降低；支链氨基酸由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸3种必需氨基酸组成，经支链α-酮酸脱氢酶复合物催化生成酰基辅酶A（包括乙酰辅酶A、琥珀酰辅酶A和HMG辅酶A）进入三羧酸循环[25]，而3种氨基酸及乙酰辅酶A的下游产物柠檬酸均在给予AAEO后含量降低；赖氨酸可加速乙酰辅酶A的合成进而促进三羧酸循环[26]，谷氨酸代谢同样与三羧酸循环相互连接，代谢组学显示二者在AAEO组下调。表明AAEO可以导致机体代谢紊乱而产生毒性。
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综上，AAEO为蕲艾主要的毒性组分，其毒理学机制归纳为通过抑制PAH表达遏制酪氨酸生物合成，进而干扰三羧酸循环能量代谢及相关氨基酸代谢。本研究利用代谢组学与网络药理学整合分析明确了蕲艾引起肝毒性的化学组分及作用机制，为解决艾叶产业的发展瓶颈提供了科学依据。

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