主题：【分享】杜仲盐制前后胶丝力度与色度值及特征成分含量的相关性研究

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发表于：2024/09/13 21:49:26 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

杜仲为杜仲科杜仲属植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮，为我国名贵药材，在中医药方面的使用已有2 000多年的历史，《神农本草经》将其列为上品。杜仲具有补肝肾、强筋骨和安胎功效，用于治疗肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩、妊娠漏血和胎动不安等，目前常应用于临床的饮片主要为杜仲和盐杜仲[1]。杜仲经盐炙后，可缓和燥性、滋阴降火，增强补肝肾作用[2]。有文献报道，杜仲盐炙前后总氨基酸、总黄酮、总多糖以及京尼平苷、京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、阿魏醛、中脂素、松脂素、表松脂素等成分含量会有明显差异[3-4]。经课题组前期研究，发现京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷为杜仲盐炙前后主要差异特征成分[5]。杜仲胶是杜仲内存在的一种天然高分子材料[6]，主要成分为反式聚异戊二烯[7]，具有耐疲劳性能、粘接性能、物理机械性能等优点，其形态会随温度而改变[8-10]。杜仲炮制后杜仲胶的胶丝力度（F）产生显著变化，利用这一特性，《中国药典》将其作为盐杜仲炮制程度的判断依据之一，即要求“炒至断丝”。在生产实际中，盐杜仲在炒至断丝时，药典规定的指标成分松脂醇二葡萄糖苷往往达不到要求。饮片的颜色也是其炮制程度和饮片质量的判断依据之一[11-12]，目前，大都是靠肉眼判断。近年来，机器视觉技术——电子眼（色度）在中药饮片质量方面的应用研究越来越多[13]，可通过饮片的色度来客观地判断饮片炮制程度，为其质量评价研究提供参考[14-15]。因此，有必要考察杜仲胶的F与杜仲饮片颜色（色度）、特征成分之间的相关性，为判断炮制品的质量提供依据。

本实验针对杜仲饮片盐制前后杜仲胶的F、色度值L*、a*、b*、Eab*及京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的含量进行检测，分析盐制杜仲饮片F与外观颜色及其特征成分含量的相关性，为盐杜仲饮片的定性判别和质量控制提供科学依据。

1 仪器与材料
1.1 仪器
Instron3343型材料试验机，美国英斯特朗公司；U3000型高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；CM-5型分光测色仪，日本柯尼卡美能达有限公司；ME-204E型电子分析天平（0.01 g）、XS105型电子分析天平（0.01 mg），瑞士梅特勒托利多公司；DFT-200型手提式高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DFD-700型电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；Canon EOS-50D型数码单反相机，佳能（中国）有限公司。
1.2 试样
对照品京尼平苷酸（批号111828-201805，质量分数为98.1%）、绿原酸（批号110753-201817，质量分数为96.8%）、金丝桃苷（批号111521-201809，质量分数为94.9%）、松脂醇二葡萄糖苷（批号111537-201706，质量分数为91.7%）、京尼平苷（批号110749-201919，质量分数为97.1%），均购自于中国食品药品检定研究院；对照品京尼平（批号21041202，质量分数99.40%）购自成都格利普生物科技有限公司。乙腈，色谱纯，美国Tedia公司；磷酸，分析纯，浙江汉诺化工科技有限公司；甲醇，分析纯，广东光华科技股份有限公司；纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司。
生杜仲饮片15批，编号为SP1～SP15，其中SP1～SP10为试验品，SP11～SP15为验证集，均购自浙江中医药大学中药饮片有限公司，由浙江中医药大学药学院葛卫红教授鉴定，为杜仲科杜仲属植物杜仲E. ulmoides Oliv.干燥树皮的加工品，样品均保存于浙江中医药大学中药饮片有限公司留样室。
2 方法与结果
2.1 样品的制备
盐杜仲饮片是由生杜仲饮片制备而来的延续性样品（炮制工艺：取生杜仲，加盐水，闷透，置炒制容器中，220 ℃加热炒制7～9 min，至丝易断、表面焦黑色，取出放凉，即得。每100千克杜仲，用食盐2 kg拌匀），编号为YP1～YP15，其中YP1～YP10为试验品，YP11～YP15为验证集。生杜仲饮片和盐杜仲饮片样品见图1。
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2.2 杜仲胶胶丝拉力测试
2.2.1 测试条件将15批生品（SP1～SP15）和盐制品（YP1～YP15）均统一为长×宽×高＝2.0 cm×2.0 cm×0.6 cm的规格，放入材料试验机中，测试位移速度30 mm/min，小位移0.5 mm拉断，再进行胶丝拉力测试。
2.2.2 胶丝拉力（F）结果与生品相比，杜仲饮片盐制后F明显下降。表1结果显示，生杜仲饮片平均F均在5 N以上，盐杜仲饮片平均F均在5 N以下，明显区分为2类。对比盐制前后各批次样品F，YP1～YP15的F较炮制前均显著降低。提示杜仲饮片在盐制过程中F可能会呈现减弱的趋势。
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2.2.3 杜仲胶丝延展性分析杜仲胶F的动态变化如图2所示，生杜仲饮片样品的F到达最高点后，其在24～25 s的F趋近于0；而在盐杜仲饮片样品中，F在14～15 s便趋近于0；说明盐杜仲饮片中杜仲胶F的下降时间短于生杜仲饮片，其胶丝延展性相较于生杜仲饮片差。
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2.2.4 聚类分析将30个样品的F数据导入SPSS 26.0进行聚类分析，结果如图3所示，从中看出，生杜仲饮片与盐杜仲饮片样品可以较明显的分为2类，说明可根据F的不同来对杜仲饮片盐制前后样品进行区分判别。
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2.3 杜仲盐制前后色度定性判别模型的建立
2.3.1 色度检测方法光源为D65脉冲氙灯，光源标准观察角度10°，目标孔径4 mm，测量波长范围为360～740 nm，重复性标准偏差ΔE在0.07以内，采用SCI反射光模式进行测定。取过三号筛的杜仲样品粉末适量，平铺于检测皿底部，重复测定色度3次，以均数为最终测定结果，得出明暗度（L*）、红绿色度（a*）、黄蓝色度（b*），同时通过公式计算总色度值［Eab*，Eab*＝(a*2＋a*2＋a*2)1/2］。
2.3.2 精密度试验取杜仲样品SP1粉末，装入测色皿中，均匀分布，按“2.3.1”项下色度检测方法进行样品颜色测定，连续测定6次，记录其L*、a*、b*值，计算Eab*值，得到各色度值的RSD分别为0.01%、0.09%、0.09%、0.01%，各指标的RSD值均≤1%，表明仪器精密度良好，符合实验要求。
2.3.3 重复性试验取杜仲样品SP1粉末6份，装入测色皿中，均匀分布，按“2.3.1”项下色度检测方法进行6份样品颜色测定，记录其L*、a*、b*值，计算Eab*值，得到各色度值的RSD分别为0.26%、0.46%、0.65%、0.28%，各指标的RSD值均≤1%，表明方法重复性良好，符合实验要求。
2.3.4 稳定性试验取杜仲样品SP1粉末，装入测色皿中，均匀分布，按“2.3.1”项下色度检测方法分别于0、2、4、6、8、10 h（将第1次的样品粉末均匀分布后开始测定，同时从当前时间开始计时）进行样品颜色测定，记录其L*、a*、b*值，计算Eab*值，得到各色度值的RSD分别为0.35%、0.96%、0.88%、0.36%，各指标的RSD值均≤1%，表明样品稳定性良好，符合实验要求。
2.3.5 样品色度测定结果取杜仲生品（SP1～SP15）和盐制品（YP1～YP15）粉末，按“2.3.1”项下方法进行检测，记录其L*、a*、b*值，计算Eab*值。表2结果显示，杜仲生品L*、a*、b*、Eab*分别为51.27～53.06、5.69～6.10、11.78～13.10、52.95～54.99；盐制品L*、a*、b*、Eab*分别为48.00～49.61、4.98～5.64、9.88～11.44、49.30～51.10。杜仲饮片盐制后，其L*、a*、b*、Eab*均下降，这与炮制前后饮片由黄褐色变为焦黑色的颜色变化相符，表明盐制后杜仲饮片的L*、a*、b*、Eab*会发生不同程度的变化。

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2.3.6 色度定性判别模型的建立将采集到的杜仲样品色度数据导入SIMCA 14.1软件进行处理。采用正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）建立杜仲盐制过程色度定性判别模型，同时采用置换检验对模型进行验证，所得结果如图4、5所示，色度聚类趋势符合炮制变化的趋势。
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同时，通过验证集（SP11～S15、YP11～Y15）考察模型可靠性，结果表明模型稳定可靠。由图5置换检验可知，2条回归线斜率均较大，R2和Q2分别与左侧纵轴相交于（0，?0.032 8）和（0，?0.380 0），且左侧随机排列得到的R2和Q2均要小于右侧的原始值，说明原始模型的预测能力大于随机一次排列Y变量的预测能力，证明模型有效、可靠，且未出现过拟合现象。
2.4 杜仲盐制前后样品特征成分含量测定
2.4.1 样品的制备杜仲盐制样品的制备同“2.1”项下方法进行。
2.4.2 供试品溶液的制备取杜仲样品粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（频率40 kHz、功率500 W）40 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取25 mL续滤液于蒸发皿中，蒸干，用50%甲醇定容于5 mL量瓶中，离心后取上清液，即得供试品溶液。
2.4.3 混合对照品溶液的制备取京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷对照品适量，精密称定，置于20 mL量瓶中，加50%甲醇制成质量浓度分别为3 207.87、477.22、1 029.00、299.19、1 061.89、112.93 μg/mL的混合对照品储备液，备用。
2.4.4 色谱条件色谱柱为Waters HSS-T3柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱：0～20 min，2%～30% B；20～35 min，30%～50% B；35～42 min，50%～95% B；体积流量为0.3 mL/min；柱温为50 ℃；检测波长254 nm；进样量10 μL。
2.4.5 线性关系、检测限和定量限考察量取适量对照品储备液，加50%甲醇溶液稀释定容，制备分别为原质量浓度1、1/4、1/6、1/8、1/16、1/32的混合对照品溶液，在上述色谱条件下，各质量浓度对照品溶液分别进样10 μL。以峰面积（Y）对其质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程：京尼平苷酸Y＝0.112 0 X－8.802 5，R2＝0.999 2，线性范围100.25～3 207.78 μg/mL；绿原酸Y＝0.163 8 X＋0.328 0，R2＝0.999 8，线性范围14.91～477.22 μg/mL；京尼平苷Y＝0.123 0 X－1.942 9，R2＝0.999 3，线性范围32.16～1 029.00 μg/mL；京尼平Y＝0.197 6 X＋0.058 3，R2＝0.999 7，线性范围9.35～299.19 μg/mL；松脂醇二葡萄糖苷Y＝0.140 2 X－3.607 6，R2＝0.999 4，线性范围33.18～1 061.88 μg/mL；金丝桃苷Y＝0.233 3 X－0.084 8，R2＝0.999 2，线性范围3.53～112.93 μg/mL。测定峰高为噪音3倍（S/N＝3）时的进样质量浓度为检测限，测定峰高为噪音10倍（S/N＝10）时的进样质量浓度为定量限，结果京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的检测限分别为0.26、0.01、0.10、0.11、0.16、0.04 μg/mL，定量限分别为0.88、0.04、0.32、0.36、0.53、0.12 μg/mL。
2.4.6 精密度试验精密吸取同一批供试品溶液（SP1），按“2.4.4”项下色谱条件连续进样6次，结果显示京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷峰面积的RSD分别为0.36%、1.05%、0.26%、1.53%、0.12%、0.44%，各指标的RSD均≤2%，表明仪器精密度良好。
2.4.7 稳定性试验取同一批供试品溶液（SP1），按“2.4.4”项下色谱条件，分别在制备后0、5、10、15、20、25 h进样，结果显示京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷峰面积的RSD分别为0.42%、0.95%、0.59%、0.40%、0.42%、0.30%，各指标的RSD均≤2%，结果表明供试品溶液在室温下放置24 h稳定。
2.4.8 重复性试验取同一样品（SP1），按“2.4.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按照“2.4.4”项下色谱条件进样，记录色谱图，结果显示京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷质量分数的RSD分别为0.30%、0.91%、1.79%、0.64%、0.55%、1.29%，各指标的RSD均≤2%，表明该方法重复性良好。
2.4.9 加样回收率试验精密称取6份杜仲样品（SP1）各2.0 g，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，根据供试品中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的质量分数浓度，以1∶1的比例加入对照品，按“2.4.4”项下方法检测，并计算各成分含量与及其回收率。结果京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的平均加样回收率分别为99.08%、102.83%、100.48%、97.39%、97.27%、103.44%，RSD分别为1.22%、1.33%、1.29%、2.61%、2.10%、1.01%，RSD值均≤3%，说明方法准确度良好，符合实验要求。
2.4.10 样品测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，得到各样品色谱图，提取峰面积数据，采用标准曲线法计算样品中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的质量分数，结果如表3与图6所示。
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2.4.11 成分权重分析将采集到的杜仲样品含量数据导入SIMCA 14.1软件进行处理。采用OPLS-DA建立杜仲盐制前后含量定性判别模型，结果见图7-A，RX2＝0.466，RY2＝0.871，Q2＝0.805，表示拟合的预测模型较可靠，盐制前后的杜仲成分含量能够较好地聚为2类。
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同时以变量重要性投影（variable importance projection，VIP）值≥1、|pcorr|≥0.5为条件，筛选对样本结果产生较大影响的化合物，对各成分权重配比，所得结果如图7-B、C，京尼平苷酸VIP值≥1且|pcorr|≥0.5，贡献最大，京尼平苷、绿原酸与金丝桃苷的|pcorr|≥0.5，贡献次之，而松脂醇二葡萄糖苷与京尼平VIP值＜1且|pcorr|＜0.5，贡献最低。因此，权重占比可设置为京尼平苷酸（35%）、京尼平苷（15%）、绿原酸（15%）、金丝桃苷（15%）、松脂醇二葡萄糖苷（10%）、京尼平（10%）。置换检验结果见图7-D，R2和Q2分别与左侧纵轴相交于（0，0.124）和（0，?0.405），且左侧随机排列得到的R2和Q2均要小于右侧的原始值，说明原始模型的预测能力大于随机一次排列Y变量的预测能力，证明模型有效、可靠，且未出现过拟合现象。
2.5 F与样品色度及特征成分含量相关性分析
2.5.1 皮尔逊双变量相关性分析采用SPSS软件对样品F数据与色度值数据、特征成分含量数据进行皮尔逊双变量相关性分析，结果如表4所示，金丝桃苷的含量以及色度值L*、a*、b*、Eab*与F呈显著正相关，京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷的含量与F呈显著负相关，松脂醇二葡萄糖苷、京尼平的含量与F无显著相关性。
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2.5.2 偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）分析利用SIMCA 14.1软件进行PLSR分析，首先以杜仲盐制前后6个成分含量作为自变量（X），以杜仲盐制前后的F均值作为因变量（Y1）；其次，杜仲盐制前后的色度值L*、a*、b*、Eab*作为自变量（X），以杜仲盐制前后的F均值作为因变量（Y2），进行相关性分析，建立回归方程。结果如表5所示，因变量（Y1、Y2）的回归方程分别为Y1＝?0.167 X1－0.167 X2－0.167 X3－0.167 X4＋0.167 X5＋0.167 X6，Y2＝0.25X1＋0.25 X2＋0.25X3＋0.25 X4。
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结果显示，杜仲盐制前后的胶丝力度均值与京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平的含量呈负相关，与松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的含量呈正相关；杜仲盐制前后的F均值与色度值L*、a*、b*、Eab*呈正相关。
3 讨论
杜仲在盐制时，断丝是其炮制经验鉴别、质量评价最常用的指标，然而传统人工经验的判定往往受主观因素的影响，缺乏客观、可量化的标准[16-17]，要实现质量快速识别，则要求检测手段具有快速、无损、易于操作的优势。近年来，分光测色仪逐渐应用到中药颜色测定中[18-19]，可以将光谱数据量化，快速测定饮片粉末、提取液的色度值，分析速度快，可实现在线分析，为中药炮制进行精确客观的质量控制提供技术支持[20-21]。
本研究利用材料试验机测定杜仲盐制前后样品的F变化，采用测色仪对盐制前后杜仲饮片色度值进行测定，发现杜仲饮片盐制后的F会显著降低，L*、a*、b*、Eab*也会不同程度的降低；采用HPLC法测定京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的含量，发现杜仲盐制后金丝桃苷的含量降低，京尼平苷酸、绿原酸与京尼平苷的含量增加，松脂醇二葡萄糖苷和京尼平的含量无明显变化。同时，分析了杜仲盐制前后的成分权重，结果表明京尼平苷酸的贡献度最大，京尼平苷、绿原酸与金丝桃苷的贡献度稍次，松脂醇二葡萄糖苷与京尼平的贡献度最低。
在含量-色度-F相关性分析中，松脂醇二葡萄糖苷、京尼平的含量与F无显著相关性，与权重分析结果一致，这2个成分影响最小。此外，结合相关性分析与F-色度的PLSR分析，表明杜仲饮片F与色度值L*、a*、b*、Eab*均呈显著正相关。结合F-含量的PLSR分析结果表明，F与金丝桃苷的含量显著正相关，与京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷的含量显著负相关，但F、色度值、特征成分含量三者之间的具体联系有待后续实验进一步研究。
综上所述，本研究初步分析了杜仲盐制前后的F与含量及色度的相关性，为盐杜仲饮片的定性判别提供了科学依据，同时为杜仲盐制的质量控制提供了一种新的研究思路和理论基础。

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