主题：【分享】叶酸修饰的斑蝥素/黄芩苷共载脂质体处方工艺优化及其评价

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发表于：2024/09/13 21:48:45 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

斑蝥素（cantharidin）是斑蝥Mylabris中含有的一种单萜烯类活性成分与毒性成分。现代药理研究表明，斑蝥素对多种癌症如肝癌、食道癌、胃癌、肺癌、鼻咽癌、皮肤癌、卵巢癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌等均有抑制作用，斑蝥素在治疗腹水肝癌和原发性肝癌方面优势显著[1-6]。斑蝥素的抗肝癌作用主要与抑制肝癌细胞增殖及侵袭迁移、诱导细胞凋亡、诱发细胞自噬等有关，但在临床应用中发现其对泌尿系统、消化系统等存较大的不良反应[7-8]。尽管结构修饰、新剂型、新给药途径等方式在一定程度上降低了斑蝥素的不良反应，但进一步应用于临床仍存在诸多掣肘[9]。

黄芩苷（baicalin）为黄芩Scutellariae Radix中含有的黄酮类药效活性成分，具抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗肿瘤及逆转多药耐药等多种药理作用，其中保肝作用尤为突出。黄芩苷能通过B细胞淋巴瘤-2/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（B-cell lymphoma-2/cysteine aspartic protease-3，Bcl-2/ Caspase-3）信号通路诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞周期与增殖，参与其氧化应激调节[10-12]。斑蝥与黄芩配伍应用最早可追溯至明代医家龚廷贤所著典籍《万病回春》一书，其所载琥珀散中“滑石1两，白牵牛（头末）1两，斑蝥3钱（去翅足），琥珀2钱，黄芩1两，甘草3钱……”用于内消瘰疬结核具有奇效。而现代研究斑蝥与黄芩配伍应用同样也有迹可循[13-14]，比如斑蝥酸钠维生素B6注射液与以黄芩为君药的痰热清注射液联合应用于癌性发热，尤其对于肺癌、肝癌等癌性发热临床效果更佳。

共载脂质体是利用脂质体的亲水腔与脂质双分子层将不同性质的2种药物同时递送，以此来改变药物的药动学性质，延长体内作用时间，从而发挥最佳协同治疗功效[15-16]。基于中医药基础理论与脂质体共载技术，采用薄膜分散超声法将斑蝥素与黄芩苷2药配伍分载于脂质体的脂质双分子层及亲水腔，一热一寒，一辛一苦，一升一降，既可协同攻毒，又可以制约斑蝥辛热大毒之偏性，减少不良反应。
近年来，叶酸受体介导的靶向递药系统是目前药物靶向给药的研究热点之一[17]。肿瘤细胞上高表达的叶酸受体与叶酸或叶酸类似物的结合具有高特异性、高亲和性等特点，以叶酸修饰的纳米载体能提高药物在肿瘤组织的浓度，增强其生物效应[18]。因此，本课题通过单因素试验以及Box-Behnken设计-响应面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）优化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸（DSPE-PEG 2000 folate，DSPE-PEG2k-FA）修饰的斑蝥素/黄芩苷共载脂质体（DSPE-PEG2k-FA-cantharidin & baicalin-lipsomes，FA-Can&Bai-Lips）制备工艺，并对其体外抗肝癌作用予以初步研究，以期构建一种载药量多、稳定性高、靶向性好，且能提高抗肝肿瘤活性及降低斑蝥素毒性的共载脂质体，为斑蝥素制剂的临床进一步开发提供实验依据。
1仪器与试剂
XB-220A型分析天平，美国Precisa公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；R-3型旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；Scientz-ⅡD型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Agilent 1260 infinity II型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；Zetasize ZS型激光纳米粒度测定仪，英国马尔文仪器公司；TSQ8000型气相-质谱联用仪、Tecnai G2 Spirit TWIN型透射电子显微镜（TEM），美国赛默飞世尔科技公司；Galaxy170R型二氧化碳培养箱，德国Eppendorf公司；BY-400C型医用离心机，北京白洋医疗器械有限公司；DW-86L388J型超低温冰箱，中国海尔集团；SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州净化设备有限公司；DK-8AD型电热恒温水槽，中国Blue Pard公司；Enspire型多功能酶标仪，美国Perkinelmer公司；LSM800型激光共聚焦扫描显微镜，德国Zeiss公司；ChemiScope 6100型化学发光成像系统，中国上海勤翔科学仪器有限公司。
斑蝥素原料药，批号TZ180408，质量分数为99.4%，西安通泽生物科技有限公司；黄芩苷原料药（批号C22J7Y9309，质量分数90.7%）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸（DSPE-PEG2k-FA，批号S27890）、大豆卵磷脂（批号J27GS155716，质量分数＞98%）、再生纤维素透析袋（相对分子质量1 000，批号SP132638），均购自上海源叶生物科技有限公司；斑蝥素对照品（批号110783-201105，质量分数98.6%）、黄芩苷对照品（批号110715-201720，质量分数93.5%）、十八烷（批号111636-201804，质量分数100.0%），均购自中国食品药品检定研究院；胆固醇、三氯甲烷、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸、甲醇均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。
人肝癌HepG2细胞，湖南丰晖生物科技有限公司；胎牛血清（FBS，批号10270-106）、DMEM培养基（批号8115247）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（批号25200-056），均购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒（批号AI09295084），北京Bioss公司；PBS缓冲液（批号08919），美国Hyclone公司；青霉素-链霉素混合液（批号20190928），北京索莱宝科技有限公司；异硫氰基荧光素（FITC，批号BS096-50 mg）、4%多聚甲醛/通用型组织固定液（PFA，批号BL539A），均购自北京兰杰柯科技有限公司；Hoechst 33342（批号D-9105）、DiR（批号D-9111），均购自北京博奥森生物技术有限公司；其余耗材均购自美国Corning公司。
雌性BALB/c裸鼠，6～8周龄，体质量13～16 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，所有实验动物置于SPF级动物房中饲养，自由进食、饮水，实验室温度为20～26 ℃，相对湿度为40%～70%，每日12 h/12 h交替照明。所有动物实验遵循湖南中医药大学第一附属医院有关实验动物管理和使用的规定，均符合3R原则。
2 方法与结果
2.1 FA-Can&Bai-Lips制备方法考察
2.1.1 薄膜分散法按处方量称取适量斑蝥素、大豆卵磷脂、胆固醇，置于茄形瓶中，溶于氯仿与甲醇（4∶1）混合溶液中，水浴减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成均匀脂质膜。吸取一定量含黄芩苷的PBS缓冲液加入茄形瓶水化至形成脂质体混悬液后置超声波细胞粉碎机下超声（超声2 s、停止2 s），过0.22 μm微孔滤膜整粒，即得。同法制得不含斑蝥素与黄芩苷的双空白脂质体、分别不含斑蝥素与黄芩苷的单空白脂质体。其中斑蝥素与黄芩苷的含量测定方法同课题组前期研究结果[19-20]。
2.1.2 逆相蒸发法按处方量称取适量斑蝥素、大豆卵磷脂、胆固醇，置于茄形瓶中，溶于氯仿与甲醇（4∶1）混合溶液中，超声使溶解，向上述茄形瓶中均匀加入取一定量含黄芩苷的PBS缓冲液，超声至形成稳定的W/O型白色乳剂，蒸发除去有机溶剂，形成可流动的胶态溶液时，加入一定体积的PBS缓冲液继续搅拌水化至形成脂质体混悬液后置超声波细胞粉碎机下超声（超声2 s、停止2 s），过0.22 μm微孔滤膜整粒，即得。
2.1.3 乙醚注入法按处方量称取适量斑蝥素、大豆卵磷脂、胆固醇，置于茄形瓶中，并超声使其溶于乙醚。在恒温水浴磁力搅拌下，采用注射器缓慢滴入含黄芩苷的PBS缓冲液中，注入速度保持在1.0 mL/min，除去乙醚，至形成脂质体混悬液后置超声波细胞粉碎机下超声（超声2 s、停止2 s），过0.22 μm微孔滤膜整粒，即得。
2.1.4 FA-Can&Bai-Lips包封率测定精密量取脂质体溶液500 μL，加入十八烷内标溶液100 μL，加甲醇定容至5 mL，静置过夜后，超声30 min破乳，过0.22 μm微孔滤膜，分别测定斑蝥素与黄芩苷的总药量（m总）。精密量取2 mL脂质体溶液置透析袋中，精密移取5%甲醇40 mL作为透析介质，于25 ℃磁力搅拌（300 r/min）下透析45 min，取透析介质20 mL旋干，加入十八烷内标溶液0.1 mL，加甲醇定容至5 mL，超声30 min，过0.22 μm微孔滤膜，分别测定斑蝥素与黄芩苷的游离量（m游），根据公式计算包封率。
包封率＝(m总－m游)/m总
2.1.5 FA-Can&Bai-Lips制备方法的确定结果如图1所示，3种方法制备的脂质体混悬液均澄清，透明，带淡黄色的乳光，无絮凝。由表1可知，尽管逆相蒸发法与乙醚注入法制备的共载脂质体粒径小，粒度分布较为集中，但斑蝥素与黄芩苷的包封率略低于薄膜分散法。故考虑到斑蝥素的毒性，选用薄膜分散法作为共载脂质体的制备方法。
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2.2 单因素考察
2.2.1 茄形瓶装载量考察按“2.1.1”项下条件制备脂质体，固定其他因素不变，对加入茄形瓶体积5%、10%、15%、20%的溶剂进行考察，观察其成膜情况。结果如图2所示，当加入的有机溶剂为20%茄形瓶体积时，脂质膜厚度均匀。
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2.2.2 成膜温度考察按“2.1.1”项下条件制备脂质体，固定其他因素不变，分别于40、45、50、55 ℃条件下减压旋转蒸发除去有机溶剂，观察其成膜情况。结果如图3所示，确定55 ℃为成膜温度。
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2.2.3 总药量考察按“2.1.1”项下方法制备FA-Can&Bai-Lips，固定其他因素不变，分别对总药量（m斑蝥素∶m黄芩苷＝1∶5）1.5、3.0、6.0、9.0、12.0 mg进行考察，测定包封率。结果如表2所示，当总药量为6.0 mg时，斑蝥素与黄芩苷的包封率最佳，故选择总投药量为6.0 mg进行后续工艺优化试验。
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2.2.4 药脂比考察按“2.1.1”项下条件制备脂质体，固定其他因素不变，分别对药脂比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25进行考察，测定包封率。结果如表3所示，随着磷脂量的增加，包封率呈现先升高后降低的趋势，且当药脂比为1∶10时，斑蝥素与黄芩苷的包封率出现了峰值，故选择1∶8、1∶10、1∶12的药脂比进行后续试验优化。
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2.2.5 胆脂比考察按“2.1.1”项下条件制备脂质体，固定其他因素不变，分别对胆脂比1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20进行考察，测定包封率。结果如表4所示，随着胆固醇量的减少，斑蝥素与黄芩苷的包封率呈现先增高后降低的趋势，且当胆脂比为1∶1时，脂质体混悬液极不稳定，出现絮凝现象，说明药脂比对脂质体包封率的影响显著，故选择1∶4、1∶5、1∶6的胆脂比进行后续试验优化。
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2.2.6 水化温度考察按“2.1.1”项下条件制备脂质体，固定其他因素不变，分别对水化温度40、45、50、55、60 ℃进行考察，测定包封率。结果如表5所示，随着水化温度的升高，斑蝥素与黄芩苷的包封率呈现逐渐增高的趋势，且55 ℃的粒度分布更为集中，故选择50、55、60 ℃的水化温度进行后续试验优化。
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2.2.7 水化时间考察按“2.1.1”项下条件制备脂质体，固定其他因素不变，分别对水化时间25、50、75、100、125 min进行考察，测定包封率。结果如表6所示，随着水化时间的延长，斑蝥素与黄芩苷的包封率呈现先升高后降低的趋势，其中水化时间为100 min时两者包封率均最高；共载脂质体粒径随水化时间变化的趋势与包封率基本一致，且不同水化时间的粒度分布差别不明显，故选择80、100、120 min的水化时间进行后续试验。
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2.2.8 水化介质考察按“2.1.1”项下条件制备脂质体，固定其他因素不变，分别对水化介质纯化水、pH 6.0、pH 6.8、pH 7.0的PBS缓冲液进行考察，测定包封率、平均粒径、PDI、ζ电位。结果如表7所示，不同的水化介质对共载脂质体ζ电位的影响较大，粒径随着pH值的增加而增加，但分布更集中，但在pH 6.8的PBS缓冲液水化介质中形成的共载脂质体的斑蝥素与黄芩苷的包封率最高，故选择pH 6.8的PBS缓冲液作为水化介质。
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2.2.9 水化体积考察按“2.1.1”项下条件制备脂质体，固定其他因素不变，分别对水化体积5、10、15、20 mL进行考察，测定包封率、平均粒径、PDI、ζ电位。结果如表8所示，随着水化体积的增加，共载脂质体粒子更为分散，ζ电位则有所增加。当水化体积为10 mL时，斑蝥素与黄芩苷的包封率最高，且粒径较适宜，粒度分布相对均匀，故选择10 mL作为水化体积。
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2.2.10 超声时间考察按“2.1.1”项下条件制备脂质体，固定其他因素不变，分别超声2、3、5、8、10 min（超声2 s、停止2 s）进行考察，测定包封率、平均粒径、PDI、ζ电位。结果如表9所示，随着超声时间的延长，脂质体粒径逐渐减小，粒度分布更集中。当超声8 min时，斑蝥素与黄芩苷的包封率前后变化较小，故选择8 min作为其超声时间。
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2.3 BBD-RSM优化共载脂质体处方工艺
2.3.1 实验设计与结果结合上述单因素考察试验结果，发现药脂比、胆脂比、水化温度、水化时间对共载脂质体的制备影响较大，故采用响应面法对共载脂质体制备工艺进行进一步优化，以药脂比（X1）、胆脂比（X2）、水化温度（X3）、水化时间（X4）为考察因素，以斑蝥素（Y1）和黄芩苷（Y2）包封率、PDI（Y3）和ζ电位（Y4）综合评分（Y）为评价指标，设计4因素3水平进行试验。因素与水平及结果见表10。
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2.3.2 模型拟合及验证采用EvaGear软件的熵权法对4个分指标进行赋权，得斑蝥素包封率、黄芩苷包封率、PDI、ζ电位的权重系数分别为0.42、 0.34、0.10、0.14，根据实验结果，采用Design Expert 8.0软件，进行2次多项回归分析，回归方程为Y＝63.850＋2.650 X1＋7.740 X2－0.705 X3－1.270 X4－0.344 4 X1X2－0.397 1 X1X3－1.850 X1X4＋0.705 X2X3＋1.240 X2X4＋0.588 6 X3X4－12.630 X12－1.860 X22－4.160 X32－4.410 X42，R2＝0.912 8。对回归模型进行方差分析，回归模型P＜0.000 1，失拟项P＞0.05，说明模型选择合理，拟合度好；其中X2、X12极显著，X1、X32、X42显著，其他项不显著。方差分析结果见表11。
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采用Design Expert 8.0软件绘制因素与响应值关系的三维效应面图，结果见图4。随着各因素的增大，Y值呈现先增大后减小的趋势，且各因素对Y值影响大小为胆脂比＞药脂比＞水化时间＞水化温度，考虑到水化温度对脂质体的影响较小，最终确定最佳工艺为药脂比1∶11、胆脂比1∶6、水化温度55 ℃、水化时间94 min。对优化后的制备工艺进行验证实验，结果见表12，斑蝥素与黄芩苷的包封率均高于85%，且实际值与预测值相对偏差小于5%，说明采用BBD-RSM实验优化的共载脂质体具有良好的预测性及可靠性。
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2.4 靶向分子投入量考察
按照“2.3.2”项下最佳处方工艺制备脂质体，分别对磷脂总量5%、10%、15%、20%的DSPE-PEG2K-FA投入量进行考察，测定其平均粒径、PDI、ζ电位、包封率。结果见表13，当靶向分子投入量的增大，粒径有所增加，脂质体外观与粒度分布呈负相关，且投入量为10%时，脂质体外观澄清，透明，带淡黄色乳光，斑蝥素、黄芩苷的包封率均在85%以上，ζ电位适宜，粒径稳定，粒度分布均匀。
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2.5脂质体的表征
2.5.1 粒径分布及ζ电位考察取少量脂质体样品，采用蒸馏水稀释10倍左右置于比色皿中，利用纳米粒度仪测定其粒径分布及ζ电位情况。粒径分布及ζ电位图如图5所示，可见，FA-Can&Bai-Lips粒径在100 nm左右，分布均匀，带负电荷。
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2.5.2 粒径分布及ζ电位取少量FA-Can&Bai-Lips滴于附有支撑膜的200目铜网上，静置3 min后，用滤纸吸去多余液体，再滴加2%磷钨酸进行染色，低温吹干溶液，置于TEM下观察脂质体的微观形态，结果见图6，脂质体外观圆整，大小均匀，为类球形粒子。
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2.5.3 稳定性考察将脂质体放置于4 ℃、避光保存28 d，以第1周每天、每隔7 d检测1次的频率采用动态光散射粒度仪测定粒径变化情况。结果见表14，在4 ℃、避光条件下，FA-Can&Bai-Lips在1周时间内保持稳定，粒径没有明显变化，具有较好的稳定性。
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2.6 脂质体的评价
2.6.1 溶血性评价将一定量供试品与2%的家兔红细胞混悬液混合，温育一定时间后，观察其对红细胞状态是否产生影响。
取洁净EP管9支并编号，其中，1～6号管为供试品管，7号管为阴性对照管，8号管为阳性对照管，9号管为供试品对照管，分别加入规定量的2%红细胞悬液、0.9%氯化钠溶液、去离子水，混匀，立即置（37.0±0.5）℃的恒温箱中进行温育3 h后，将其低温离心（4 ℃、6 000 r/min）10 min，以上清液颜色和底部红细胞剩余量为指标，观察溶血和凝聚反应并拍照，结果见图7。取上清液，以第9管作为参比溶液，于576 nm处测定吸光度（A），计算溶血率。各试验组方案及溶血率结果见表15，FA-Can&Bai-Lips各组溶血率均低于5%，符合注射剂的要求。
溶血率＝(A样－A阴)/(A阳－A阴)
A样为样品的吸光度值，A阴为阴性对照的吸光度值，A阳为阳性对照的吸光度值
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2.6.2 细胞摄取评价将对数生长期的HepG2细胞以1×105个/孔密度，接种于12孔培养板中，培养24 h细胞贴壁，分别加入FITC-Lips和FA-FITC-Lips溶液，使FITC质量浓度为4 μg/mL，共同孵育1、2、3、4、5 h后，采用PBS多次洗涤除去吸附在细胞外的FITC，采用PFA进行固定20 min，以1 mg/mL Hoechst 33342染细胞核15 min，PBS洗涤多次后，置CLSM（100×）下观察脂质体（绿色）进入细胞的情况，并以Image J软件进行半定量计算FITC平均荧光强度。
图8结果显示，FA-FITC-Lips组中绿色荧光的亮度比FITC-Lips组高，说明叶酸受体阳性表达的HepG2细胞对叶酸受体靶向脂质体的摄取效率高于非靶向脂质体；表16结果显示，与1 h相比，HepG2细胞在处理4 h后对FA-FITC-Lips的摄取具有统计学意义（P＜0.05），且4 h后基本达到平衡，说明由叶酸受体介导的主动摄取具有饱和性。
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2.6.3 细胞毒性评价将对数生长期HepG2细胞 1×104个/100 μL接种于96孔板中，加入总药量为质量浓度为0.6、3.0、6.0、15.0、18.0、30.0、45.0、60.0、72.0、90.0 μg/mL的斑蝥素溶液、斑蝥素/黄芩苷混合溶液（m斑蝥素∶m黄芩苷＝1∶5）和FA-Can&Bai-Lips，培养48 h后吸出含药培养基，并用100 μL PBS缓冲液洗涤1次后，每孔加入100 μL完全培养基和10 μL CCK-8溶液，置细胞培养箱中孵育2 h后，在酶标仪上检测A值（450 nm），以空白培养基为对照，计算细胞存活率，并用GraphPad Prism 8.0软件计算半数抑制浓度（IC50，以药物总量计算）。
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表17结果显示，斑蝥素溶液、斑蝥素/黄芩苷混合溶液和FA-Can& Bai-Lips对HepG2细胞的IC50值分别为（11.40±3.28）、（15.79±4.07）、（12.62±1.45）μg/mL，结果表明，在对HepG2细胞发挥相同毒性效应时，斑蝥素/黄芩苷混合溶液所需的斑蝥素剂量，较单独斑蝥素溶液降低了76.9%，FA-Can &Bai-Lips中斑蝥素剂量降低了81.6%，说明黄芩苷的加入与DSPE-PEG2K-FA的修饰，能增加脂质体对HepG2细胞增殖的抑制作用。
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2.6.4 靶向性评价 BALB/c裸鼠动物适应性饲养7 d后，在每只小鼠右侧腋下接种8×106个/mL的HepG2细胞悬液0.1 mL，待小鼠右腋部皮下肿瘤大小为8 mm×8 mm后，将5只BALB/c裸鼠随机分成3组，其中对照组1只、FA-DiR-Lips 2只、DiR-Lips 2只，给药前小鼠禁食不禁水12 h后，按0.1 mL/20 g iv 2%戊巴比妥溶液，待麻醉后，尾iv含质量浓度为1 mg/mL的DiR标记脂质体0.1 mL，置于活体成像仪中，于6 h时拍照，对照组注射同体积生理盐水。拍照模式为荧光模式。激发波长748 nm，发射波长为780 nm，曝光时间为7 s，观察两者在体内的分布情况。从图9可以看出，FA- DiR-Lips组肿瘤组织部位荧光强度明显强于身体其他部位，DiR-Lips组肿瘤组织部位暂无明显荧光，但肝脏部位荧光较强。结果表明，叶酸修饰的共载脂质体能有效增加肿瘤组织的靶向能力。
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3 讨论
一种良好纳米载体需要具备有高药物包载量、高靶向部位蓄积能力、高自身稳定性等多方面的性质，选择适宜的制备方法并通过控制膜组分比例、外界温度、pH值、离子强度等因素对纳米载体性能起着关键影响作用[21-22]。常见的脂质体制备方法中，注入法虽能避免使用有毒溶剂，但其操作过程长，易产生溶剂残留，在选择乙醚做溶剂时会产生沸腾现象，使成膜不均匀；逆相蒸发法适合于包载水溶性药物或大分子药物，经过超声整粒后易致水腔中药物发生泄露，且重复性较差；薄膜分散法包裹脂溶性药物的能力强，操作过程简单可控，缺点在于易产生溶剂残留[23-27]。
通过对比3种方法制得脂质体的粒径大小及分布、ζ电位、包封率等，确定选择薄膜分散-超声法制备共载脂质体。采用单因素实验与Box-Behnken试验优化最佳处方工艺为总药量为6 mg、药脂比1∶11、胆脂比1∶6、DSPE-PEG2K-FA用量为10%、溶剂为50 mL、旋转蒸发及水化温度为55 ℃、水化介质为pH 6.8 PBS缓冲液、水化体积为10 mL、水化时间为94 min，超声时间为8 min。
纳米载体实现不同部位靶向的首要条件是适宜的粒径，50～200 nm的脂质体，能有效减少单核巨噬细胞的摄取，通过毛细血管孔隙重新进入体循环，从而能进一步增加其在靶向部位的蓄积，保证包载药物的药效[28-29]。研究表明，聚合物材料载体或脂质材料载体作为给药载体必须要求PDI至少小于0.2或小于0.3[30]。FA-Can&Bai-Lips的粒经小于200 nm，PDI小于0.2，2药包封率均在85%以上，且粒径、PDI及ζ电位较为适宜。通过对FA-Can&Bai-Lips的外观、形态、稳定性及溶血性进行初步评价，证实其符合后续体内实验的静脉注射要求。
理想的脂质体是能在达到靶部位前与药物保持稳定且完整的结合体，达到靶部位后，在酶或者靶部位内环境的作用下，释放药物，使药物发挥治疗作用[31]。脂质体在血液中的稳定性是发挥其载体作用的关键，如何有效避免脂质体因酶类物质降解或巨噬细胞吞噬一直是脂质体的主要研究方向[32]。经聚乙二醇修饰的长循环脂质体能在表面形成构象云而不被血液中调理素所识别，从而减慢清除速率[33]。细胞毒性试验及活体成像结果表明，利用叶酸受体在肝癌细胞表面高表达特性，经叶酸修饰的共载脂质体能高度识别肝癌细胞，高效靶向肿瘤组织，增加药物蓄积而发挥抗肝癌作用。
综上所述，Box-Behnken法优化制备得得FA-Can&Bai-Lips包封率高、稳定性及安全性好，能显著增加对HepG2细胞增殖的抑制作用，且靶向性高，为该制剂的进一步开发及应用提供科学依据。

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