主题：【分享】基于网络药理学及分子对接探讨青风藤治疗痛风性关节炎的作用机制

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发表于：2024/09/13 22:01:53 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

目前，痛风已成为一种高发的代谢性疾病，在我国位居第4位[1]。据2017年数据显示，我国高尿酸血症患病率高达13.3%，其中痛风患者数量超过1.2亿[2]。Zhu等[3]对1990—2019年的痛风患病率趋势进行了调查，结果显示中国有1 620万名痛风患者。痛风通常经历4个阶段，从无症状的高尿酸血症，到痛风急性发作，间歇期，最终进入慢性期[4]。急性期的痛风发作迅猛，伴有难以忍受的疼痛，这与炎症密切相关，主要是因为尿酸晶体在关节和周围组织中沉积，引发免疫细胞的聚集，释放白细胞介素（IL）-1β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症介质[5]。最终症状包括疼痛、红肿、发热等典型的炎症表现，特别是第一跖趾关节容易受累。痛风急性关节炎的发作给患者带来了心理和身体上的痛苦。有相关的治疗指南建议以减轻关节症状为治疗急性痛风发作的目标，常用药物包括秋水仙碱、非甾体抗炎药和皮质类固醇，它们可以减少关节渗液、具有抗炎和抗损害作用[4]。这些药物起效迅速，但停药后容易复发，且大量长期使用可能导致胃肠道不适和肝肾毒性[6-8]。
青风藤来源于防己科植物青藤和毛青藤的干燥藤茎[9]，具有镇痛、抗炎和祛风湿的功效，常用于治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。Jia等[10]进行了1项随机对照实验，比较了青风藤和秋水仙碱在预防痛风发作方面的疗效，结果显示青藤碱的疗效可能比秋水仙碱和非甾体抗炎药更理想。本研究采用网络药理学和分子对接技术，旨在预测青风藤治疗痛风急性关节炎的活性成分、关键靶点以及作用机制。

1 材料与方法
1.1 青风藤活性成分的筛选
通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMS）筛选青风藤的活性成分[11-12]。在TCMSP的搜索框中输入关键词“青风藤”，检索青风藤的有效成分数据。以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性系数（DL）≥0.18为检索条件搜索筛选成分，获得青风藤的有效成分[13]。将所有成分通过Pub Chem[14]数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获得Smiles号分别导入SwissTargetPrediction[15]（http://swisstarget prediction.ch//）数据库，物种限定人为“homo spapiens”，“Probability≥0.1”，预测成分的靶点。
1.2 疾病关键成分靶点筛选
以“gout”“gout arthritis”“hyperuricemia”为关键词，分别输入到GeneCards[16]（https://www. genecards.org）、OMIM[17]（https://www. omim.org）、DisGenet[18]（https://www.disgenet.org/）和TTD[19]（http://db.idrblab.net/ttd/）等数据库中分别与痛风相关的基因靶点，其中GeneCard的Relevance score设置≥1为检索条件。然后，通过Excel软件进行上述数据库的疾病靶点汇总，删除重复基因构建痛风靶点数据库。最后通过Venny 2.1.0网站获得中药与疾病交集的关键靶点。
1.3 构建蛋白相互作用（PPI）网络图
将青风藤与痛风交集靶点输入到STRING[20]（http://string-db.org/）数据库中的“multiple proteins”模块，并设置交互作用最小值为 0.4，将物种设置为人类（Homo sapiens），得到PPI网络TSV文件,将TSV文件导入Cytoscape[21]软件（版本3.9.1），利用CytoHubba插件分析，获得关键靶点的PPI网络。
1.4 基因功能与通路富集分析
将青风藤与痛风交集靶点输入到DAVID[22]（http://david.ncifcrf.gov/），将物种设置为人类（Homo sapiens），进行关键靶点的基因本体（GO）生物学富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。以P＜0.01为筛选标准，分别纳入GO分析中生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）的前10位和KEGG通路分析中前20位的项目做下一步分析。
1.5 用Cytoscape绘制“药物–成分–靶点–通路”网络图
将1.1项获得的有效成分与1.4项下最显著的通路映射到所得的交集靶点，导入Cytoscape 3.9.1软件构建“药物–成分–靶点–通路”网络图，再次分析交集靶点并展示活性成分与交集靶点、通路之间的交互作用关系。
1.6 活性成分与关键靶点的分子对接
选择PPI网络图中degree值排名前的核心靶点作为受体，活性成分作为配体，两两对应进行分子对接的相关验证。首先，在PubChem数据库中下载青风藤6个活性成分3D结构的SDF格式，使用Openbabel软件将化合物的SDF格式转化为PDB格式，导入Autodock Tools软件中加氢后导出为pdbqt文件。在PBD（https://www.rcsb.org/）数据库中下载核心靶点蛋白文件，使用Pymol软件去除水分子与配体，使用AutoDock Tools软件进行加氢后导出pdbqt文件。最后，将所得到的配体小分子和受体大分子一起导入Autodock Tools软件中，计算得到相应的结合能数据。使用Pymol软件绘制青风藤关键活性成分与核心靶点蛋白之间的模式图，并将关键活性成分与各自所得最高的核心靶点分子对接进行可视化。
2 结果
2.1 青风藤活性成分与靶点收集
在 TCMSP数据库中，搜索青风藤，以OB≥30%和DL≥0.18为筛选条件获得6个有效活性成分，见表1，分别为青藤碱、β-谷甾醇、拉兹马宁碱、乌心石环氧内脂、千金藤啶碱，经SwissTarget Prediction数据库预测，合并且去重，最终预测得到268个青风藤的成分靶点。
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2.2 痛风性关节炎相关的靶基因
利用 GeneCards、OMIM、Disgenet和TTD数据库筛选痛风性关节炎相关的靶基因，并删除重复项目，共获得1 168个靶基因。将1 168个疾病靶点与青风藤活性成分的268个作用靶点取交集后获得84个关键靶点，见图1。
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2.3 青风藤与痛风靶点PPI网络图
将84个交集靶点导入STRING数据库进行PPI网络分析，构建共同靶点的PPI网络，去掉游离的靶点，置信度设置为0.4，PPI网络图包含83个节点，483条边。导入Cytoscape 3.9.1根据CytoNCA选择介度中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（degree），依据degree值越大，颜色越深，圈越大，见图2A。在利用插件Huabba得到前10个核心靶点。分别为过氧化物酶体增殖物活化受体G（PPARG）、转录因子AP-1（JUN）、半胱天冬酶3（CASP3）、前列腺素内过氧化物酶2（PTGS2）、Toll 样受体（TLR4）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、诱导型一氧化氮合酶（NOS2），结果表明这些核心靶点被认为青风藤治疗痛风的核心靶基因，见图2B。
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2.4 GO和KEGG通路富集分析
运用DAVID在线数据库，对共同靶点进行GO功能富集分析，得到146条BP条目、28条CC条目和36条MF条目，按P值进行由小到大排序，取排名前10位的条目进行作图，见图3。结果显示，BP主要包括对脂多糖的反应，蛋白磷酸化、细胞对缺氧的反应等；CC涉及膜筏、细胞膜、受体复合物、胞液等；MF主要体现蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、RNA聚合酶II转录因子活性、蛋白酪氨酸激酶活性等。KEGG通路分析得到101条信号通路，以P值大小为筛选标准，取排名前20位的信号通路，运用微生信在线绘气泡图，见图4。该通路主要涉及癌症、乙型肝炎、晚期糖基化终末产物及其受体（AGE-RAGE）、脂质与动脉粥样硬化、TNF信号通路、核因子-κB（NF-κB）信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化等相关通路。
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2.5 “青风藤–活性成分–通路–靶点”网络构建
以1.1项获得的6个有效成分与1.4项下最显著的前20条通路映射到所得的交集靶点，建立“青风藤–活性成分–通路–靶点”的网络Excel，并导入Cytoscape 3.9.1软件构建“青风藤–活性成分–通路–靶点”网络图，见图5。结果表明，PPARG、JUN、CASP3、PTGS2、TLR4、MMP9、NOS2为该网络的核心靶点，与2.3项下前10个核心靶点的结果大部分重叠，该网络展示了青风藤通过多组分、多靶点、多通路治疗痛风性关节炎发作。
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2.6 分子对接
选取青风藤6个有效成分青藤碱、β-谷甾醇、拉兹马宁碱、乌心石环氧内脂、千金藤啶碱与PPI网络分析所得7个靶点PPARG、JUN、CASP3、PTGS2、TLR4、MMP9、NOS2进行分子对接并计算其结合能，见表2。研究表明，有效成分（配体）与交集靶点（受体）结合能越小，构像就越稳定，当两者的结合能力＜?4.25 kcal/mol（1 cal＝4.2 J）时，表明有一定的结合能力；结合能＜?5 kcal/mol，有较好结合能力，而结合能＜?7 kcal/mol时，有强力的结合能力[23-24]。青风藤与痛风性关节炎疾病的分子对接中，结合能力最小的为?8.3 kcal/mol，最大的为?4.7 kcal/mol，说明二者结合活性较好，本研究选取结合能力最小的6对进行可视化对接，见图6。
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3 讨论
本研究采用网络药理学方法对青风藤活性成分、作用靶点、相关信号通路及其治疗痛风发作作用机制等进行探讨，并对其活性成分与相关核心靶点进行分子对接，根据OB≥30%、DL≥0.18及符合类药性五原则筛选，共筛选出6种活性化合物和84个潜在青风藤治疗痛风发作的疾病靶点。通过“活性成分–靶点”网络分析发现青藤碱、β-谷甾醇主要的化合物可能是青风藤治疗痛风性关节炎的关键作用。
研究表明，青风藤主要由生物碱、三萜类化合物和挥发油组成。其中青藤碱是主要活性成分[25]。肖敬等[26-27]研究发现，青藤碱可以有效降低大鼠滑膜悬液中IL-6水平、IL-6 mRNA表达以及关节液中的白细胞和中性粒细胞水平，从而抑制炎性细胞因子的恶性循环，对痛风性关节炎起到治疗作用。此外，曹沛莹等[28]研究发现青风藤总生物碱能够降低痛风模型大鼠血清中尿酸水平，抑制炎症因子的生成，对肝肾功能具有保护作用。de Souza等[29]在实验中发现β-谷甾醇能够显著减轻由单钠尿酸晶体引起的关节肿胀。说明β-谷甾醇具有抗炎作用，且有助于缓解痛风性关节炎的症状。
本研究通过核心PPI图确定了多个与痛风炎症密切相关的靶点基因，包括PPARG、PTGS2、TLR4、NOS2、JUN等。van Durme等[30]的研究表明PTGS2在痛风中呈现显著上调，PTGS2参与合成前列腺素，促进炎症反应和疼痛感觉。在痛风性关节炎患者中，MSU晶体会诱导炎症细胞产生NOS2，NOS2会催化一氧化氮（NO）的产生，导致关节组织的损伤，NOS2还可以通过诱导炎症细胞产生其他促炎因子，如IL-1β和TNF-α，进一步加剧炎症反应[31]。TLR4在MSU中也有重要作用，MSU可以直接与细胞膜上的TLR4结合，激活NF-κB通路这条主要的炎症反应通路，进而促进炎症因子的产生[32]。磷酸化的JUN与其他AP-1成员（如FOS）形成二聚体，调节转录活性，从而影响炎症和代谢基因的表达，通过抑制JNK的活化，可以减轻痛风炎症的程度[33]。上述靶点基因均以不同机制参与炎症发生过程，青风藤总生物碱和β-谷甾醇可以降低尿酸水平，从而减少炎症反应，这可能是青风藤在治疗痛风性关节炎过程中的作用靶点之一。而分子对接显示NOS2、PPARG、TLR4与有效成分的结合能力均＜?8 kcal/mol，这意味着这些有效成分与目标靶点的相互作用非常强烈，可以形成稳定且有效的复合物。这种结合能力不仅反映了青风藤的有效成分与目标靶点之间的亲和力，也预示了它们在体内可能产生的药效。
GO分析结果显示，相关靶点主要影响细胞膜上的受体信号转导，进而调节细胞的CC，具有调节蛋白磷酸化、基因转录等的MF和主要对抗炎症、免疫调节以及抗缺氧等BP是青风藤的治疗作用。在KEGG通路分析过程中，本研究发现脂质与动脉粥样硬化、TNF信号通路显示出最为显著的富集现象，而晚期糖基化终末产物及其受体（AGE-RAGE）、NF-κB信号通路也较为突出，这些通路在痛风性关节炎的发病及发展中起着关键作用。据Uyanik[34]等的研究发现，痛风关节炎患者的动脉粥样硬化发生率较高。这一现象与组织因子途径抑制剂（TFPI）水平较高和凝血酶B（TAFI）水平较低有关。TFPI的升高可能与内皮损伤和早期动脉粥样硬化有关，而TAFI的降低可能与其具有抗炎作用和防止无症状高尿酸血症（AHU）进展为痛风性关节炎的能力有关。研究表明TNF-α能够诱导血管内皮细胞表达黏附分子，刺激单核-巨噬细胞分泌IL-1和IL-6，并招募白细胞至炎症部位引起痛风炎症发作[35]。而青风藤可以减少TNF-α、IL-6的炎性因子的表达[36]。潘显阳等[37]的研究显示，痛风性关节炎患者急性炎症与TLR4/NF-κB及IL-1β信号通路激活相关，促进炎症反应的发生。总之，这些基因蛋白和通路都可以增加炎症细胞的浸润和活化，从而导致炎症反应的加剧。
经过网络药理学分析，青风藤的有效成分如青藤碱和β-谷甾醇，与共同的靶点PTGS2、PPARG、NOS2、JUN等相互结合，参与了免疫和炎症相关信号通路以及多个生物细胞过程的调控。这些结果表明，青风藤治疗痛风性关节炎的机制是多种成分、多靶点、多通路协同作用的结果。

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