主题：【分享】肉桂酸促进糖尿病小鼠创面愈合及创口修复细胞迁移作用研究

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发表于：2024/09/13 21:53:58 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

糖尿病是一种表现为代谢紊乱的内分泌疾病，是威胁公众健康的3大疾病之一[1]。预计到2050年，全球糖尿病患者人数将达到13.1亿[2]。糖尿病溃疡是糖尿病患者最常见的血管并发症[3]，其主要是由高血糖环境、缺血缺氧以及持续扩大的炎症反应引起[4]，是世界范围内非创伤性肢体截肢的主要原因。越来越多的证据表明，血管新生障碍导致的氧气和营养物质无法运送至受伤组织，显著延缓了糖尿病患者伤口愈合。目前针对糖尿病溃疡的临床治疗方法包括局部清创、抗生素治疗、血管重建和活体皮肤等效移植等[5]。虽然这些标准的治疗方法可以控制症状，但仍无法满足糖尿病创面愈合的需求，有效的糖尿病伤口再生的治疗方法仍然难以捉摸，治愈率差强人意，严重影响患者生活质量，因此，急需寻找一种新型且有效的治疗药物。

肉桂酸是一种天然存在的芳香酚酸类物质，广泛存在于肉桂、葡萄、菠菜等食物中，是日常香料和果蔬中最丰富的酚酸之一，同时还是治疗糖尿病的常见中药如桂枝、当归等的活性成分。研究表明，肉桂酸可以改善db/db小鼠的空腹葡萄糖水平，调节血脂及改善胰岛素抵抗[6]。同时，反式肉桂酸可通过蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和p38-丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路诱导成纤维细胞的迁移[7]。Choi等[8]研究表明肉桂酸可通过上调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和激酶插入域受体（kinase insert domain receptor，Flk-1/KDR）表达促进内皮细胞迁移和血管生成。然而，肉桂酸是否影响糖尿病引起的慢性伤口愈合尚未得到证实。本研究选用db/db小鼠皮肤损伤模型模拟糖尿病创面并建立创口修复细胞迁移模型，探讨肉桂酸对糖尿病小鼠创面愈合的影响及可能机制。

1材料
1.1动物与细胞
SPF级雄性野生型（C57BL/6JNju，db/+）小鼠6只和糖尿病（BKS.Cg-Dock7m+/+Lepr db/JNju，db/db）小鼠16只，8～12周龄，均由南京大学南京生物医学研究所提供，动物生产许可证号SCXK（苏）2015-0001。动物于中国医学科学院生物医学放射工程研究所动物房中分笼饲养，12 h交替照明，自由进食饮水，温度22～25 ℃，相对湿度40%～60%。动物实验按照天津中医药大学动物保护与使用委员会批准的指导方针进行（伦理批准号TCM-LAEC2019098）。
小鼠RAW264.7巨噬细胞、HaCaT角质形成细胞、NIH-3T3成纤维细胞购自中国科学院，人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）购自美国ATCC。
1.2药品与试剂
肉桂酸（批号DR0063，质量分数≥98%）购自成都德斯特生物科技有限公司；羧甲基纤维素钠购自天津元力立化工有限公司；RIPA缓冲液（批号R0010）购自北京索莱宝生物科技有限公司；三溴乙醇（批号T48402）购自美国Sigma公司；Trizol试剂（批号15596-026）购自美国Life Technology公司；磷酸酶抑制剂（批号0469132001）、蛋白酶抑制剂（批号0490837001）、PMSF（批号P0100）、反转录试剂盒（批号4897030001）、荧光定量试剂（批号4913914001）购自瑞士Roche公司；MTS Assay试剂盒（批号ab197010）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（批号ab5694）、Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG二抗（批号ab150080）购自英国Abcam公司；凝集素（批号 AL-1103）、抗大豆凝集素一抗（批号AS-2104-1）、DyLight594标记的抗山羊IgG二抗（批号DI-3094-1.5）购自美国Vector Laboratories公司；EGM-2培养基（批号CC-4147）、胎牛血清（批号CC-3156）购自瑞士Lonza公司；DMEM培养基（批号06-1055-57-1A）购自美国BI公司；晚期糖基化终末产物活性蛋白（advanced glycation end products，AGEs，批号APB353Ge01）、VEGFA购自武汉云克隆科技有限公司。
1.3仪器
Leica S8APO型体视显微镜（德国Leica公司）；ECLIPSE TE300型倒置荧光显微镜、ECLIPSE TS100型倒置相差显微镜、ECLIPSE型倒置式生物显微镜（日本Nikon公司）；Flex Station 3型多功能酶标仪（美国Molecula Device公司）；IncuCyte Zoom实时动态活细胞成像分析仪（美国ESSEN公司）。ACCU-CHEK® Performa Nano血糖仪及试纸条（瑞士Roche公司）。
2 方法
2.1 体内实验
2.1.1 造模、分组及给药 db/db小鼠适应性喂养1周后，ip三溴乙醇（16.5 mL/kg）麻醉，脱毛，固定，在小鼠背部中线处形成6 mm全层切除皮肤创面。将环形硅胶夹板固定在创面周围，用5-0缝线缝合。用庆大霉素对伤口进行消毒，并用Tegaderm无菌透明敷料覆盖伤口，每2天更换1次无菌透明敷料。将16只皮肤损伤小鼠随机分为模型组和肉桂酸（10 mg/kg）组，每组8只，另取6只野生型小鼠作为对照组。肉桂酸组ig相应药物，对照组和模型组ig羧甲基纤维素钠溶液。造模同时开始给药，连续给药16 d。
2.1.2 体质量和血糖监测造模后，每日称定小鼠体质量，记录给药16 d各组小鼠体质量变化。每2日对小鼠尾尖取血，采用配套血糖仪及试纸对随机血糖浓度进行检测。
2.1.3 创口愈合分析造模后，每2天拍照记录创口面积，测量创口闭合程度。采用Image J软件对创面闭合程度进行量化，计算创面愈合率。
创面愈合率＝1－给药后创口面积/给药前创口面积
2.1.4 创面皮肤组织病理观察于实验第16天颈椎脱臼处死小鼠，取创面皮肤组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋组织，切片脱蜡复水后，进行苏木素-伊红（HE）和Masson染色。于显微镜下观察并拍照，分析创面组织结构、肉芽组织及胶原沉积情况。
2.1.5 创面皮肤组织新生血管观察小鼠于处死前30 min尾iv凝集素（用1 mL HBS缓冲液稀释），取创面皮肤组织石蜡包埋组织，切片脱蜡复水、抗原修复、漂洗、封闭，滴加抗大豆凝集素一抗（1∶100），4 ℃孵育过夜；滴加DyLight 594标记的抗山羊IgG荧光二抗（1∶200），室温孵育30 min，滴加DAPI染核，封片，于荧光显微镜下观察并采集图像。
2.2 体外实验
2.2.1 细胞培养 RAW264.7细胞、HaCaT细胞、NIH-3T3细胞用含10%胎牛血清和1%青霉素（100 U/mL）-链霉素（100 mg/mL）的DMEM，在37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养；HUVEC细胞用含5%胎牛血清和生长添加剂的EGM-2培养基，在37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，细胞融合度达到85%～90%时传代。
2.2.2 肉桂酸对M1型巨噬细胞促炎因子表达的影响采用qRT-PCR法检测RAW264.7细胞中白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA表达。取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，接种于6孔板中，每孔2 mL。培养24 h后，设置对照组、模型组和肉桂酸（10、20、40 μmol/L）组，每组设置3个复孔。对照组培养基中仅加入0.1% DMSO；模型组及各给药组在培养基中加入1 ng/mL AGEs，各给药组给予不同浓度的肉桂酸干预48 h后，收集细胞，按照试剂盒说明书提取总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析，检测IL-1β、TNF-αmRNA表达。引物序列见表1。
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2.2.3 肉桂酸对HUVECs管状形成和迁移的影响
（1）细胞活力测定：取处于对数生长期的HUVECs，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞计数后，以2.5×103个/孔接种于96孔板中。置于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中培养12 h后，倒置显微镜下观察细胞生长情况，设置对照组（含0.1% DMSO）和不同浓度的给药组（分别加入终浓度为0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000、80.000μmol/L的肉桂酸），每组6个复孔。给药后干预24 h，避光条件下每孔加入20 μL MTS。于37℃、5% CO2的孵箱中避光孵育2 h后，采用酶标仪测定490 nm处的吸光度（A）值，检测细胞活力。
（2）细胞迁移实验：将HUVECs以1×105个/孔接种于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h后，使用96孔细胞划痕器对细胞进行机械刮伤。设置对照组和不同浓度（5、10、20、40 μmol/L）肉桂酸组，取出培养基，D-Hank’s洗涤2次，按照实验分组置换成含5%胎牛血清的DMEM完全培养基放入细胞培养箱继续培养，在倒置显微镜40倍镜下拍照记录，记为0 h；细胞放回培养箱继续培养24 h，再次进行拍照记录。相差显微镜下观察记录不同时间点细胞迁移情况，用Image J软件统计划痕面积，计算划痕愈合率。
划痕愈合率＝1－各时间节点划痕面积/0 h划痕面积
（3）Matrigel基质胶成管实验：将新鲜Matrigel溶胶平铺于96孔培养板上，迅速转移进37 ℃无菌培养箱，待Matrigel溶胶凝固后，将HUMCEs以2×104个/孔接种于96孔板中，设置对照组（含0.1% DMSO）、肉桂酸（10 μmol/L）组和VEGFA（0.1 mg/L）组，继续培养18 h，倒置光学显微镜下观察HUMCEs的血管生成情况并拍照记录，使用Image J软件分析成管结构的节点数。
2.2.4 肉桂酸对NIH-3T3细胞迁移及III型胶原（Collagen Ⅲ）和α-SMA表达的影响
（1）细胞活力测定：NIH-3T3细胞以2.5×103个/孔接种于96孔板中。设置对照组和不同浓度（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000、80.000 μmol/L）肉桂酸组，每组6个复孔。按“2.2.3（1）”项下方法处理24 h，检测细胞活力。
（2）细胞迁移实验：将NIH-3T3细胞以1×105个/孔接种于96孔板中，设置对照组和不同浓度（10、20、40、80 μmol/L）肉桂酸组，按“2.2.3（2）”项下方法处理10 h，计算划痕愈合率。
（3）免疫荧光法检测NIH-3T3细胞中α-SMA蛋白表达：NIH-3T3细胞以5×104个/孔接种于12孔板中，设置将对照组（含0.1% DMSO）、肉桂酸（20 μmol/L）组，每组设3个复孔，培养48 h后，用1 mL PBS洗涤2次，5 min/次；加入1 mL 3.7%多聚甲醛固定10 min，加入1 mL PBS洗涤4次，用1 mL 0.1% Triton透化3～5 min；加入1 mL PBS洗涤4次，加入1%牛血清白蛋白封闭30 min；取出玻片置于载玻片上，加入100 μL α-SMA一抗（1∶200），4℃孵育过夜；将玻片取出置于24孔板内，加入1 mL PBS洗涤3次，加入200 μL二抗（1∶250），37 ℃避光孵育2 h；加入1 mL PBS洗涤，加入200 μL DAPI溶液避光染色10 min，PBS洗涤后，于倒置荧光显微镜200倍镜下观察染色的细胞，每孔观察6个随机视野，拍照并计数染色阳性的细胞。
（4）qRT-PCR检测NIH-3T3细胞中α-SMA、Collagen Ⅲ mRNA表达：将NIH-3T3细胞以2×105个/孔接种于12孔板中，设置对照组和肉桂酸组（20 μmol/L），分别给药培养6、12、24、48 h，收集细胞，按“2.2.2”项下方法进行qRT-PCR分析。引物序列见表1。
2.2.5 肉桂酸对HaCaT细胞迁移的影响
（1）细胞活力测定：HaCaT细胞以2.5×103个/孔接种于96孔板中。设置对照组和不同浓度（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000、80.000 μmol/L）肉桂酸组，每组6个复孔。按“2.2.3（1）”项下方法处理24 h，检测细胞活力。
（2）细胞迁移实验：设置对照组和不同浓度（10、20、40 μmol/L）肉桂酸组，按“2.2.3（2）”项下方法处理48 h，计算划痕愈合率。
2.3 统计学分析
采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量资料以表示，两组间比较采用LSD-t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两间比较采用LSD法检验。
3 结果
3.1 肉桂酸对糖尿病小鼠体质量及血糖的影响
如图1-A所示，造模期间对小鼠体质量及血糖进行监测，在给药前，模型组与肉桂酸组小鼠体质量及血糖无差异，对照组较模型组与肉桂酸组有显著差异。给药16 d后，与模型组比较，肉桂酸组小鼠体质量及血糖无下降趋势，提示给药16 d后，肉桂酸干预对db/db糖尿病小鼠体质量及血糖无明显影响。
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3.2 肉桂酸对糖尿病小鼠伤口愈合的影响
如图1-B、C所示，模型组及肉桂酸组在创伤后小鼠创面愈合率均显著低于对照组（P＜0.001），肉桂酸组和模型组之间比较，前11 d创面愈合率均未见统计学意义，第12～16天肉桂酸组小鼠创口面积明显缩小，创面愈合率升高，差异具有显著性意义（P＜0.05）。
3.3肉桂酸对糖尿病小鼠皮肤创面肉芽组织及胶原沉积的影响
如图2所示，HE染色结果显示，与模型组比较，肉桂酸组小鼠新生肉芽组织厚度较厚，且表皮结构连续完整，可见大量成纤维细胞增殖，胶原纤维生成较多，且排列较整齐。Masson染色结果显示，肉桂酸组小鼠创口处胶原沉积明显，创面胶原纤维排列整齐；对照组小鼠创面显示出稀疏和无序的低水平胶原蛋白沉积。
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3.4肉桂酸抑制M1型巨噬细胞促炎因子表达
采用AGEs诱导的RAW264.7细胞模型考察肉桂酸对创口愈合过程中炎症反应的影响。AGEs诱导RAW264.7细胞48 h，如图3-A、B所示，与对照组比较，模型组IL-1β、TNF-α mRNA表达水平明显升高（P＜0.001），提示巨噬细胞炎症模型建立成功。与模型组比较，肉桂酸组IL-1β、TNF-α mRNA表达水平均显著降低（P＜0.01、0.001），呈剂量相关性，表明肉桂酸可以防止M1型巨噬细胞过度分泌IL-1β及TNF-α，降低糖尿病创面炎症失调导致的M1和M2表型转换紊乱，减轻过度炎症并缩短炎症持续时间。
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3.5 肉桂酸促进糖尿病小鼠创面愈合中的血管生成
显微镜观察糖尿病小鼠真皮旁创面血管及血液循环情况，如图4-A所示，与模型组比较，肉桂酸组微血管密度更高，血供更充足。Lectin免疫荧光结果显示，肉桂酸组Lectin+信号增加（P＜0.01，图4-B、C），表明肉桂酸显著促进糖尿病小鼠创口周围毛细血管形成，促进伤口愈合。
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为考察肉桂酸是否对HUVECs有血管生成作用，进行细胞迁移实验及小管形成实验。MTS法检测不同浓度肉桂酸对HUVECs细胞活力影响，结果显示肉桂酸（0.625～40 μmol/L）对HUVECs活力无显著影响（图5-A）。体外划痕实验发现，与对照组比较，10、20、40 μmol/L肉桂酸处理HUVECs 6 h后，细胞迁移率显著升高（P＜0.05，图5-B、C）。使用HUVECs进行小管形成实验，结果显示，肉桂酸处理HUVECs 18 h后体外成管节点明显增加（P＜0.001，图5-D），管腔明显形成，表明肉桂酸具有促进HUVECs的成管能力。
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3.6肉桂酸诱导糖尿病创面细胞外基质重塑
为进一步确定肉桂酸如何影响创面肉芽组织形成，体外进行NIH-3T3细胞划痕实验。首先检测其对NIH-3T3细胞活力影响，如图6-A所示，不同浓度（0.625～80.00 μmol/L）肉桂酸对NIH-3T3细胞活力无明显影响。如图6-B、C所示，与对照组比较，10、20、40、80 μmol/L肉桂酸处理NIH-3T3细胞10 h后，细胞迁移率均显著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。如图6-D所示，与对照组比较，20 μmol/L肉桂酸处理NIH-3T3细胞48 h后，α-SMA阳性细胞数量增加。qRT-PCR检测肌成纤维细胞标志物α-SMA及细胞外基质相关基因Collagen IIImRNA的表达（图6-E），结果显示，与对照组比较，10、20 μmol/L肉桂酸组α-SMA、Collagen III mRNA表达水平均显著升高（P＜0.01、0.001）。
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3.7肉桂酸增加糖尿病创面的再上皮化
采用划痕实验观察肉桂酸对HaCaT细胞的迁移能力的影响，如图7-A所示，肉桂酸（0.625～80 μmol/L）对HaCaT细胞活力无明显影响。如图7-B、C所示，与对照组比较，10、20、40 μmol/L肉桂酸处理HaCaT细胞48 h后，细胞迁移率均显著升高（P＜0.05、0.001），表明肉桂酸可刺激HaCaT细胞迁移。
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4 讨论
在健康个体中，正常的伤口愈合是一个复杂的生物学过程，包括凝血期、炎症期、增殖期和重塑期4个阶段[9]。不同的细胞类型、生长因子和细胞因子在创口愈合各个阶段发挥重要作用。在创面形成后，血小板释放生长因子将白细胞招募至受损区域，引发伤口愈合的炎症期[10]。在炎症后期单核细胞分化为巨噬细胞，启动伤口愈合的增殖阶段，促进创伤修复细胞（包括内皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞）迁移、增殖和分化，这些细胞负责血管生成、肉芽组织形成、细胞外基质沉积、伤口收缩和再上皮化等过程[11-12]。在创面愈合的重塑期，参与增殖期的细胞凋亡，留下一个成熟的、基本无血管的、细胞较少的环境。而在糖尿病患者体内，过度炎症、内皮细胞和成纤维细胞功能障碍导致血管生成和胶原合成受阻、再上皮化延迟等，最终导致创面愈合延迟或不愈[4]。
本研究通过建立db/db小鼠切除创面夹板模型，对肉桂酸是否影响糖尿病后创面愈合进行研究。结果显示，给予肉桂酸16 d后，糖尿病小鼠体质量及血糖浓度与造模前相比均无显著变化。与对照组比较，造模第12天时，肉桂酸组小鼠创面愈合加快，HE染色和Masson染色也显示创面肉芽组织和胶原蛋白沉积明显增加，表明肉桂酸可促进创面修复但对血糖浓度无影响，其可能是治疗糖尿病引起的慢性伤口愈合的有效药物。
在创口愈合的炎症期，糖尿病创面炎症反应的延迟和失调是导致糖尿病后创面愈合延迟甚至不愈的主要原因之一[13]。过度的炎症反应会导致巨噬细胞表型转化紊乱，使炎症反应早期M1型巨噬细胞释放促炎因子增多，延缓皮肤愈合[14]。本研究通过建立AGEs诱导的RAW264.7细胞炎症模型，进一步分析巨噬细胞极化情况。结果显示，肉桂酸可以减少巨噬细胞促炎因子表达，缓解体外M1型巨噬细胞过度极化。进一步证明肉桂酸可减轻过度炎症并缩短炎症持续时间，促进糖尿病创口愈合。
血管生成是伤口愈合的另一个重要因素，血管为伤口部位提供充足的氧气和营养物质以供组织生成。与正常皮肤创面愈合过程相比，糖尿病创面由于长期高糖的不良刺激，导致血管受损和创面愈合延迟，进而导致血管生成因子分泌、内皮细胞迁移或增殖和再上皮化减少[15-16]。体外实验结果显示，与对照组比较，肉桂酸能促进HUVECs的迁移和成管。体内研究进一步证明，肉桂酸可显著改善糖尿病创面的新生血管形成，最终促进糖尿病创面愈合。
成纤维细胞是伤口肉芽组织中发现的主要细胞，负责胶原蛋白合成和细胞外基质沉积[17]。在伤口愈合增殖期，成纤维细胞从稳态进入激活状态，其迁移能力显著加强并分化出肌成纤维细胞，具有更强收缩特性的肌成纤维细胞能更快地合成细胞外基质从而加速伤口闭合[18-19]。成纤维细胞向肌成纤维细胞表型变化的实质是成纤维细胞内转录并合成α-SMA[20]，其是肌成纤维细胞的特征标记物，可调节细胞外基质并促进损伤后的物理组织完整性。胶原蛋白和纤维连接蛋白是细胞外基质的重要组成部分，有助于肉芽组织的完整性和输送生长因子[21]。本研究结果表明，肉桂酸处理可促进db/db小鼠伤口愈合，增加胶原蛋白生成；肉桂酸能够刺激NIH/3T3细胞迁移和肌成纤维细胞分化。同时，肉桂酸可显著上调参与胶原蛋白形成的相关基因（Collagen III、α-SMA）表达。
在创面愈合过程中，角化细胞在伤口上增殖和迁移以进行再上皮化和大量肉芽组织的形成是评估伤口愈合成功的关键早期标志[22]。本研究结果显示，肉桂酸在体外能够促进HaCaT细胞的迁移能力，并在体内促进了创伤后第16天伤口的再上皮化过程（图8）。
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糖尿病导致的创面修复是一个多因素参与的过程，本研究发现肉桂酸具有显著的促糖尿病创面修复作用，其机制可能与抑制炎症因子释放，促进创伤修复细胞迁移，促进创面细胞外基质生成、周围新生毛细血管形成和上皮化有关。

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