主题：【分享】基于数据挖掘与实验验证的抗湿疹中药筛选及活性研究

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发表于：2024/09/13 21:50:46 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

随着经济发展和人们生活水平的提高，因护肤品不当使用、生活习惯改变，慢性皮肤疾病在我国发病率呈现逐年上升趋势[1-3]。湿疹是一类慢性、复发性、瘙痒性、炎症性皮肤疾病，且多伴随细菌等微生物感染，为皮肤科常见难治性疾病[4-6]。现代临床多根据病因及临床症状进行对症治疗，如采用抗生素治疗原发或继发微生物感染性湿疹[7]，采用糖皮质激素、抗组胺药抑制湿疹过敏反应、降低炎症介质释放，采用维生素、免疫调节剂等进行湿疹的辅助治疗[8-9]。这些药物多存在停药后复发性高、长期用药不良反应大等不足[10-11]。
中药在维持皮肤屏障功能方面具有较好作用，其所含抗菌活性物质能够抑制致病微生物的生长和繁殖，促进皮肤细胞对磷脂、固醇、角质蛋白等有益成分的吸收[12-14]。基于中药防治皮肤病的长期人用经验及维持皮肤结构和功能完整性等方面的优势，从中医经方、验方中挖掘具有护肤活性的中药及其组合物，并进行实验验证，是目前研发湿疹类防治药物的热点之一[15-17]。湿疹与机体的代谢密切相关，通过分析和比较湿疹治疗前后机体内源性差异性代谢物，有助于该类疾病生物标志物和药物作用靶标的发现[18]。因此，本研究基于数据挖掘方法从中医经方、验方中筛选抗湿疹活性中药，结合实验研究对核心药物组合及单味药的抑菌活性进行测定，在此基础上采用湿疹模型小鼠，对核心药物组合抗湿疹药效进行评价，并利用超高效液相色谱串联质谱（ultra high performance liquid chromatograph-mass spectrometry，UHPLC-MS）代谢组学技术，检测核心药物组合治疗湿疹小鼠的血清中内源性差异代谢物，预测相关代谢通路，为临床应用和进一步药物研发提供参考。
1 材料与方法
1.1 数据挖掘
1.1.1 数据来源及筛选以“湿疹”“湿疮”“浸淫疮”“旋耳疮”为关键词，通过检索华柄数据中方剂数据库（http://www.huabeing.com），共得到相关治疗湿疹的外用方共686首，在结果中筛选适合数据挖掘的方剂。参照《中国药典》2020年版一部、《中药学》第9版，剔除含有重金属或有毒药物的处方。如处方中含有朱砂、磁石、雄黄、硫磺、砒石、水银、红粉、轻粉、黄丹、密陀僧、樟丹、银朱、铅粉、草乌、樟脑等均不列入本研究范围。
1.1.2 中药名称漂洗参照《中国药典》2020年版一部、《中药学》第9版，并结合《中药大辞典》中药来源及名称，对上述中医方剂或中成药处方中药物名称进行漂洗和统一。如“川柏”“黄柏”统一为“黄柏”等，“石膏”区分为“煅石膏”和“石膏”，“白矾”区分为“白矾”和“枯矾”，其余中药加工方法不做区分。
1.1.3 数据录入与数据分析采用一人录入、一人复核方法将收集到的处方信息录入中医传承计算平台软件（V3.0），确保数据的真实性和可靠性。对纳入的方剂信息进行归纳整理，利用计算平台软件数据分析系统中自带的组方分析功能进行药物的频次统计，采用关联规则分析中药的组方规律。
1.2 体外抑菌活性实验
1.2.1 药物与试剂苦参（豆科植物苦参Sophora flavescens Ait. 的干燥根）、蛇床子［伞形科植物蛇床Cnidium monnieri (L.) Cuss. 的干燥成熟果实］均购于北京同仁堂晋中药店有限责任公司，经山西中医药大学刘计权教授鉴定符合《中国药典》2020年版规定；磷酸二氢钾（批号20180921），天津市天力化学试剂有限公司；氢氧化钠（批号20160804），天津市科密欧化学试剂有限公司；牛肉膏（批号20211218）、蛋白胨（批号20211024），北京奥博星生物科技有限责任公司；琼脂（批号2018906）、氯化钠（批号20181109）。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）均来自山西中医药大学中药与食品工程学院微生物实验室。
1.2.2 仪器 DY04-13-44-00立式压力蒸汽灭菌器，上海东亚压力容器制造有限公司；SCB-1520超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；HXP-9082MBE电热恒温培养箱，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；EX125ZH型十万分之一电子天平，奥豪斯仪器常州有限公司。
1.2.3 药液的制备取粉碎的苦参、蛇床子、苦参-蛇床子（2∶1）粉末各10 g，置于圆底烧瓶中，加入75%乙醇100 mL回流提取2次，每次40 min，合并2次滤液，减压浓缩至干，得率分别为10.91%、10.24%、10.66%，加无菌水配制为1.00 g/mL的储备液，根据实验需求稀释至相应浓度。
1.2.4 培养基的制备称取一定比例蛋白胨、牛肉膏及氯化钠，加入蒸馏水1 000 mL使溶解，调节pH至7.2～7.4，加入琼脂溶解至煮沸状态，滤过，分装后，压力蒸汽灭菌制得琼脂固体培养基。上述方法不加入琼脂制得液体培养基[19]。
1.2.5 菌悬液的制备取适量灭菌后的液体培养基，用无菌接种铲刮下培养好的菌种，置液体培养基中，于37 ℃培养24 h，置于4 ℃冷藏箱中备用。取上述1 mL菌种培养液，采用无菌0.9% NaCl溶液10倍逐级稀释成0.1～1×10?7的7个梯度的菌悬液。采用平板计数法测定含菌量，控制菌悬液含菌量为1×105～1×106 CFU/mL，置2～8 ℃生物冷藏箱保存，备用。
1.2.6 抑菌圈直径测定将琼脂培养基注入培养皿，无菌条件下吸取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌供试菌菌悬液0.1 mL均匀涂布在培养基上。取苦参、蛇床子、苦参-蛇床子（2∶1）储备液1 mL，将直径为6 mm的无菌滤纸片分别浸润上述药液，取出沥干贴于培养基表面，以无菌水为阴性对照。每个实验染菌平板贴苦参、蛇床子、苦参-蛇床子各1片，阴性对照1片，共计4片，平行3次。盖上平皿盖，置于37 ℃恒温箱培养16～18 h后，观察抑菌效果，用直尺十字测量抑菌环的直径（包括贴片），评价抑菌活性。
1.2.7 最低抑菌浓度测定采用无菌水配制苦参、蛇床子、苦参-蛇床子（2∶1）系列浓度测定液（依次为原液浓度的1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1 024、1/2 048）。9支无菌试管分别标记1～9，在每支试管中加入1.5 mL液体培养基，在1～8号试管中加入0.5 mL不同浓度样品液，在第9号试管中加入0.5 mL无菌水为阴性对照，最后向各支试管内加入0.1 mL菌悬液，37 ℃培养24 h，测定苦参、蛇床子、苦参-蛇床子最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。
1.3 动物实验
1.3.1 实验动物雄性SPF级昆明种（KM）小鼠40只，体质量（40±4）g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010。动物实验由山西中医药大学伦理委员会批准（编号AWE202304296）。
1.3.2 药物与试剂苦参蛇床子凝胶（KSG）参考相关文献的制法[20]由山西中医药大学中药微乳制剂技术国家地方联合（工程）实验室自制；尤卓尔（hydrocortisone butyrate cream，Hyd，批号21111001），天津金耀药业有限公司；2,4-二硝基氯苯（2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB，批号LD50W04），北京百灵威科技有限公司；白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-6、免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附测试（ELISA）试剂盒（批号分别为20220714、20220601、20220226、20220129、20220211），凡科维上海科技有限公司；二甲苯、中性树胶（批号分别为10023418、10004160），国药集团化学试剂有限公司；苏木素-伊红（HE）染液套装（批号G1003），武汉塞维尔科技有限公司。
1.3.3 仪器 Multiskan FC型酶标仪、Donatello型脱水机、Giotto染色机，泰普生物科学中国有限公司；JB-P5包埋机，武汉俊杰电子有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；RM2016病理切片机，上海徕卡仪器有限公司；GFL-230烤箱，天津市莱玻瑞仪器设备有限公司；Axioscope5型显微镜，卡尔蔡司上海管理有限公司。
1.3.4 模型的制备、分组与给药将40只小鼠随机分为空白组、模型组、基质组（不含药的空白凝胶，150 mg/cm2）、Hyd（150 mg/cm2）、苦参蛇床子凝胶组（KSG，150 mg/cm2），每组8只。适应性饲养5 d后，于实验前1 d背部剃毛，实验当天除空白组［给予溶剂丙酮-橄榄油（4∶1）100 μL］外其余各组小鼠在背部剃毛的中心区域（2 cm×2 cm）外涂5% DNCB溶液（溶剂为丙酮-橄榄油4∶1）100 μL、右耳25 μL致敏，实验第6天于同样部位涂以0.7% DNCB 100 μL、右耳25 μL激发，空白组涂等量丙酮-橄榄油溶剂，每隔3 d激发1次，共激发4次[21]。若小鼠出现皮肤干燥、瘙痒、红肿、增厚等现象即为造模成功。空白组不予任何治疗，模型组给予蒸馏水300 μL，其余各组于第1次激发当天开始外涂给药，每日1次，持续给药14 d。末次给药24 h后处死小鼠，检测各项指标。
1.3.5 皮肤损伤评分分别于实验的第7、10、13和16天，在给药前对小鼠皮肤进行记录，并按表1进行评分。观察指标包括红肿增厚、角化结痂、渗出情况。
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1.3.6 皮损组织病理学检查每组取3只小鼠背部和右耳皮损组织，4%多聚甲醛固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋固定，切成3 mm厚片，经HE染色后，脱水，中性树胶封片，于显微镜20倍物镜下观察病理形态学变化。
1.3.7 炎症因子分析每组8只小鼠眼球取血，室温下静置0.5 h后于4 ℃、3 000 r/min离心10 min，吸取上层血清，分装，?80 ℃冰箱保存备用。采用ELISA法检测血清中IL-4、IL-6、IgE、IFN-γ、TNF-α的水平，按各相关试剂盒说明书进行测定。使用酶标仪测定450 nm波长下的吸光度，根据标准曲线，计算样本中各炎症因子的含量。
1.4 血清代谢组学
1.4.1 试剂与仪器质谱级乙腈、甲醇（批号分别为227802、223433），赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；UHPLC-Q Exactive高分辨质谱、Ulti-Mate 3000超高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.4.2 液质分析样本采集与处理取“1.3.7”项各组小鼠血清，4 ℃下解冻，取100 μL血清，加入3倍预冷的甲醇涡旋5 min，1 300 r/min离心10 min取上清，氮气吹干，加100 μL甲醇涡旋3 min，离心取上清。每个样品中取10 μL混匀作为质控（quality control，QC）样品，按照与待测样品相同的前处理方式来处理QC样品，之后进行UHPLC-MS分析，每检测8个样品检测1次QC样品，用于考察方法的稳定性和重复性。
1.4.3UHPLC-MS条件色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流动相为乙腈（A）和0.1%甲酸-水（B）；梯度洗脱：0～0.5 min，5% A；0.5～1.5 min，5%～15% A；1.5～4.5 min，15%～30% A；4.5～6 min，30%～60% A；6～9 min，60%～70% A；9～12 min，70%～100% A；12～13 min，100% A；13～13.5 min，100%～5% A；13.5～16 min，5% A。柱温40 ℃，体积流量0.3 mL/min，进样量5 μL。
电喷雾离子源（ESI），正、负离子同时扫描模式。喷雾电压3.2 kV，鞘气流速40 arb，辅助气流速5 arb，辅助气加热温度350 ℃；离子传输管温度320 ℃，S-Lens RF Level 50 V，扫描范围m/z 100～1 000，碰撞能量30 eV。
1.4.4 数据处理用Compound Discovery软件进行代谢组学数据检测，得到包含每个离子峰的保留时间、m/z值和峰面积等详细信息，对峰面积进行归一化处理。用SIMCA14.1软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least square discriminant analysis，OPLS-DA），同时结合S-plot图中变量投影重要性（variable important for projective，VIP）＞1且P＜0.05为标准筛选差异代谢物。通过人类差异代谢组数据库（HMDB）对潜在代谢物进行鉴定。用MetaboAnalyst 5.0在线分析平台对差异代谢物进行聚类分析及通路富集分析。
1.5 统计学分析
实验数据用表示，用SPSS 23.0统计软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 数据挖掘结果
2.1.1 抗湿疹中药来源统计通过数据库检索共得到符合纳入标准的外用方剂255首。不同来源医籍收载的代表方剂及组成见表2。
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2.1.2 抗湿疹中药用药频次统计采用中医传承计算平台数据分析系统对中药用药频次进行统计，255首治疗湿疹目标方剂共涉及中药347味，按频次由高到低进行排序，得到频次≥17的中药14味，其中排名前5的分别为黄柏（68次）、苦参（51次）、蛇床子（34次）、白鲜皮（31次）、枯矾（27次）、冰片（27次）、青黛（27次），结果见表3。
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上述药物中的黄柏、黄连、苦参、白鲜皮、大黄性苦而寒，功能清热燥湿、泻火解毒以疗疮，对湿热所致湿疹、湿疮具有较好的疗效；青黛咸寒以入血分，具有清热解毒、凉血消斑之功，对于热入血分之湿疹具有较好的治疗效果；蛇床子、地肤子、苍术、煅石膏、冰片具有辛散之性，能够疏散外风而不留邪，增强治疗湿疹、湿疮的药效；此外，白矾、枯矾、煅石膏、炉甘石均具有收涩之性，能够增强收湿敛疮的功效。
2.1.3 抗湿疹中药功效分析功效统计结果表明，外用治疗湿疹最主要的为清热药，占43.1%，其次为攻毒杀虫止痒药，占7.6%，且拔毒化腐生肌药、补虚药、解表药、收涩药、化湿药等也占一定的比例，结果见表4。根据祖国医学对于湿疹的认识，血热、风邪等外因及脾虚、湿重等内因是诱发湿疹的重要原因[22]，根据临床辨证，清热泻火、清热燥湿、祛风止痒、疏风解表等是其常用治法，本研究结果与此相一致。
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2.1.4 抗湿疹中药用药模式分析利用中医传承计算平台数据分析系统中的组方规律分析功能模块对目标中药用药模式进行分析。由表5可知，当设置最小支持度为12（表示药物组合在12首以上方剂同时出现，即组合使用频次大于12），且置信度为0.95（即表示A药出现时B药也同时出现的概率是95%）时，可得到9种药物组合模式，共涉及8种药物。当设置最小支持度为15，置信度为0.95时，得到4种药物组合模式，共涉及5味中药。
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为了更加直观地分析和了解药物的用药模式及配伍特点，以网络图展示不同支持度、置信度下药物组合结果。当支持度设置为12时，苦参、蛇床子、黄柏、苍术、青黛、白鲜皮、煅石膏及地肤子8味中药呈现密切关联，见图1-A。当支持度为15时，苦参、蛇床子、黄柏、青黛、白鲜皮5味中药呈现密切关联，见图1-B。综合不同支持度下结果可知，“黄柏-苦参”“黄柏-青黛”“苦参-蛇床子”为共有的高频次药物组合。结合国家药监局发布的《已使用化妆品原料目录（2021年版）》，仅有苦参-蛇床子组合单味药均收录于该化妆品原料目录。
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2.2 体外抑菌实验结果
2.2.1 抑菌圈直径苦参、蛇床子及苦参-蛇床子药液的抑菌圈直径测定结果（表6）表明，苦参、蛇床子、苦参-蛇床子组合对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有显著的抑制作用（P＜0.05），且上述药物对大肠杆菌抑制活性明显强于金黄色葡萄球菌。同等剂量下，苦参对金黄色葡萄球菌抑制活性显著强于蛇床子和苦参-蛇床子组合（P＜0.05），苦参、苦参-蛇床子组合对大肠杆菌抑制活性显著强于蛇床子（P＜0.05）。
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2.2.2 MIC 结果显示，苦参、苦参-蛇床子抑制金黄色葡萄球菌的MIC为7.81 mg/mL，远低于蛇床子的MIC（62.5 mg/mL）。类似地，苦参、苦参-蛇床子抑制大肠杆菌的MIC为3.91 mg/mL，远低于蛇床子的MIC（31.25 mg/mL）。苦参、蛇床子及其配伍抑菌情况见表7。
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2.3 动物实验结果
2.3.1 皮肤损伤评分与空白组相比，模型组皮损评分显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，各给药组小鼠皮肤的红肿增厚、角化结痂、渗出情况均有好转，从第10天开始Hyd组和KSG组评分均明显下降（P＜0.05、0.01），结果表明KSG对湿疹模型小鼠有一定干预作用，结果见表8。
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2.3.2 皮损组织病理学耳廓HE染色结果如图2所示，空白组小鼠的耳廓组织无明显改变、结构完整，真皮与表皮层次分明，无明显炎性细胞浸润。模型组小鼠耳廓组织厚度明显增加，皮肤组织结构模糊，均可见严重的角化过度、表皮棘层增厚的现象，真皮中有大量炎性细胞的浸润。Hyd组和KSG组均可以改善由DNCB反复激发造成的湿疹样组织病理学的改变。
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背部皮肤HE染色结果如图2所示，空白组小鼠的背部皮肤表皮细胞排列有序，各层次清晰，未见明显炎细胞浸润。模型组背部皮肤角化过度严重，表皮浆痂形成，轻度增生，真皮内淋巴细胞浸润明显。Hyd组及KSG组皮肤组织厚度明显降低，炎症细胞浸润明显减少。
2.3.3 血清炎症因子水平结果如图3所示，与空白组相比，模型组小鼠血清中IL-4、IL-6、IgE、IFN-γ和TNF-α水平显著升高（P＜0.01），IFN-γ与IL-4的比值显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，Hyd组和KSG组小鼠血清中IL-4、IL-6、IgE、IFN-γ和TNF-α水平显著降低（P＜0.01），IFN-γ与IL-4的比值升高（P＜0.05、0.01）。
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2.4 血清代谢组学分析结果
2.4.1 代谢轮廓数据采集各组小鼠血清样本在正、负离子模式下的总离子流图见图4。由图4可知，各样品总离子流图中最高的离子峰强度为100%，各谱峰间的分离度良好。
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2.4.2 代谢轮廓数据PCA 将含有保留时间、质荷比、峰强度等信息的各组样品代谢数据矩阵导入SIMCA14.1软件进行无监督的PCA，以获取各组样品在空间上的分布情况。如图5所示，空白组、模型组和KSG组均能大致各聚成一类，且各组之间能明显分离。在t[2]轴方向，与模型组相比，KSG对湿疹模型小鼠的代谢紊乱情况具有较好回调作用，而在t[1]轴方向未表现出相应的回调作用。
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2.4.3 代谢轮廓数据OPLS-DA 为更进一步确定各组小鼠血清内源性代谢物的差异，采用OPLS-DA对空白组与模型组、模型组与KSG组的差异代谢物进行分析。如图6所示，空白组与模型组样品能明显区分。所得模型参数在正离子模式中R2X＝0.343，R2Y＝0.992，Q2＝0.668；负离子模式中R2X＝0.373，R2Y＝0.996，Q2＝0.742，表明该模型拟合度和预测能力较好。以n＝200对模型进行置换检验，如图6-B、D所示，模型的斜率较大，并与纵坐标相交于负半轴，表明模型未出现过拟合，模型可靠。根据VIP＞1的标准及独立样本t检验P＜0.05，筛选出差异代谢物，最终得到具有显著性差异代谢物730个。
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如图7所示，模型组与KSG组样品也表现出良好的区分特性，正离子模式中R2X＝0.191，R2Y＝0.991，Q2＝0.654；负离子模式中R2X＝0.294，R2Y＝0.991，Q2＝0.871，R2Y及Q2值均大于0.5，可以进行差异代谢物的分析及筛选[23]。将上述模型随机排列200进行置换检验，发现模型的斜率较大，并与纵坐标相交于负半轴，表明模型未过拟合，模型可靠，见图7-B、D。根据VIP＞1且P＜0.05，最终得出1 029个具有显著性差异的代谢物。
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2.4.4 差异代谢物的筛选与鉴定将筛选出来的差异代谢物在HMDB数据库中鉴定，共鉴定出12个差异代谢物，见表9。空白组与模型组相比，L-组胺醇（L-histidinol）、尿酸（uric acid）、Lyso PE [0:0/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)]、8-羟基二十烷四烯酸（8-hydroxyeicosatetraenoic acid）、20-羟基白三烯B4（20-hydroxyleukotriene B4）5个差异代谢物具有下调的作用；模型组和KSG组相比，这5个差异代谢物具有上调作用，其余7个代谢物调控作用与空白组vs模型组相反。通过MetaboAnalyst 5.0进行代谢物热图分析，可以看出模型组大致聚为一类，空白组和KSG组大致聚为一类（图8）。对12个差异代谢物的相对峰面积研究发现，与模型组相比，KSG对12个差异代谢物均具有显著的回调作用（P＜0.05），见图9。推测这些差异代谢物可能与KSG治疗湿疹的通路密切相关。
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2.4.5 差异代谢物通路富集分析将12种差异代谢物输入到MetaboAnalyst 5.0数据库中构建代谢通路，得到KSG改善湿疹模型小鼠的相关通路6条，并把impact＞0的代谢通路作为潜在的靶标通路，共筛选出3条，分别为甘油磷脂代谢通路、谷胱甘肽代谢通路、甘油酯代谢通路，见图10。
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2.4.6 炎症因子和差异代谢物的相关性分析为了进一步分析差异代谢物和湿疹的相关性，本研究通过计算差异代谢物以及炎症因子两两之间的斯皮尔曼（Spearman）等级相关系数对炎症因子指标和差异代谢物的相关性进行了分析。圆圈大小和颜色表示相关性程度，红色表示正相关，蓝色表示负相关；数字蓝色表示负相关，红色表示正相关。炎症因子IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IgE与代谢物L-组胺醇、尿酸、Lyso PE [0:0/20:5(5Z,8Z, 11Z,14Z,17Z)]、8-羟基二十烷四烯酸、20-羟基白三烯B4均表现出正相关，其余代谢物表现出负相关。其中丙酮酸酰基转移酶（propionylcarnitine）与IL-4（r＞?0.53，P＜0.01）IL-6（r＞?0.64，P＜0.001）、TNF-α（r＞?0.77，P＜0.001）、IFN-γ（r＞?0.69，P＜0.001）、IgE（r＞?0.73，P＜0.001）呈显著性负相关。LysoPE [0∶0/20∶5 (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)]与IL-4（r＞0.60，P＜0.01）、IL-6（r＞0.79，P＜0.001）、TNF-α（r＞0.75，P＜0.001）、IFN-γ（r＞0.76，P＜0.001）、IgE（r＞0.75，P＜0.001）呈显著性正相关。结果见图11。
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3 讨论
湿疹是常见的变态反应性、炎症性皮肤病，由于其具有瘙痒剧烈、皮损严重等特点，严重影响着患者的学习、工作和生活[24]。随着现代生活节奏加快及环境因素等变化，湿疹在我国发病率具有加速上升的趋势，其中婴幼儿湿疹发病率已达到10%～20%[25-26]。采用抗生素、糖皮质激素等药物抑制皮肤致病微生物感染，或抑制其炎症反应是目前治疗湿疹的主要方法[8-9]。由于长期应用抗生素、激素类药物的不良反应，亟待筛选对湿疹类疾病有确切防治作用、安全性高的药物。中医对于湿疹具有较好的防治作用，根据祖国医学理论，湿疹可由多种因素引起，其中机体素虚，风、湿、热邪郁于皮肤、传变入里，导致气血失调或累及其他脏腑，是湿疹的重要诱发因素[21]。本研究基于华柄数据库，采用数据挖掘技术，挖掘具有抗湿疹活性的中药及其组合物，得到黄柏、苦参、蛇床子、白鲜皮、枯矾等高频药物，这些药物多具有清热解毒、清热燥湿或燥湿祛风、止痒等属性。
湿疹的病因学研究表明，细菌等微生物感染是湿疹诱发或继发的重要因素[7,27]。如金黄色葡萄球菌等致病菌在皮肤过度定殖后能够分泌多种超抗原特性毒素，加重皮炎症状，并与细胞黏附、聚集诱导因子骨桥蛋白的表达呈正相关趋势。苦参、蛇床子是临床常用皮肤科疾病治疗用药[28]，苦参味极苦寒，蛇床子辛苦而温，苦参苦寒在外在下之性，与蛇床子苦温辛散鼓荡之力相合，契合湿疹病机而共奏除湿止痒、散风杀虫的作用。二者药性气味走注关键之处各有不同，但相合同用却能达到互相佐助、制持有度的效果，基于临床实践和已有文献报道[29]，确定苦参与蛇床子的比例为2∶1。抗菌活性测定结果表明，经过数据挖掘筛选、结合临床经验得到的苦参-蛇床子（2∶1）核心药物组合及其组成药物具有较好的抗菌活性，且苦参对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑制作用（MIC分别为7.81、3.91 mg/mL）明显强于蛇床子（MIC为62.5、31.25 mg/mL）。此外，等剂量下的苦参-蛇床子（2∶1）核心组合对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑制作用（MIC分别为7.81、3.91 mg/mL）与苦参相当。根据苦参-蛇床子组合物MIC及组成比例分别折算该组合MIC下的单味药物浓度，苦参-蛇床子组合物抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌MIC中的苦参（5.21、2.61 mg/mL）、蛇床子（2.60、1.30 mg/mL）单味药浓度均明显低于其单独使用下浓度。亦即，在不具备产生MIC条件下的苦参、蛇床子配伍后，抗菌效能提升。然而，苦参-蛇床子的协同药效及相关机制有待进一步评价和揭示。
系统药理学研究表明，苦参-蛇床子抑制皮肤瘙痒的药效作用与免疫及神经相关信号通路有关，苦参中的黄酮及蛇床子中香豆素类化合物能够通过降低炎症因子及相关基因表达而发挥抑制皮肤瘙痒的药效作用[30]。此外，苦参中的高含量生物碱效用成分苦参碱与蛇床子中蛇床子素对致病微生物具有协同抑制作用[31]。慢性的免疫炎症损伤是湿疹发病的重要机制之一。相关研究表明，湿疹的发病机制主要与T辅助细胞所诱导的免疫反应有关，主要表现为Th1/Th2的漂移。Th1、Th2细胞特征因子IFN-γ/IL-4水平趋于平衡状态有助于缓解湿疹的症状[32]。KSG能明显减轻湿疹模型小鼠的皮损程度及皮肤的炎性细胞浸润的情况，对湿疹有明显的治疗作用。
运用UHPLC-MS代谢组学技术找出了与湿疹相关的12个差异代谢物，并构建出相关的代谢通路3条：甘油磷脂代谢、谷胱甘肽代谢、甘油酯代谢。这3条代谢通路中甘油磷脂代谢通路与湿疹密切相关，对此代谢通路进行了阐述。甘油磷脂是组成细胞膜的主要成分，而磷脂酰胆碱是甘油磷脂的一个亚类，在细胞膜中占据重要的位置。已有研究证明，饱和的LysoPC加剧促炎细胞因子的释放，加剧炎症产生[33]。LysoPC是甘油磷酯类化合物经磷酸脂酶A2水解得到的产物，在炎症反应中起着重要的作用[34]。炎症反应的发生会增加机体内炎症介质的释放，增加TNF-α、IL-1β、IL-6等相关炎症因子的产生，与炎症产生过程密切相关[35]。本实验发现，模型组小鼠血清中LysoPC及LysoPE等生物标志物代谢异常，揭示小鼠体内发生炎症反应的异常变化。而KSG给药后其相对含量趋向于空白组，说明KSG可以抑制炎症反应，相关的代谢通路可能与甘油磷脂代谢有关。
利用Spearman相关性分析法，建立治疗湿疹的炎症因子与血清差异代谢物之间的关联分析，结果显示炎症因子IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IgE与代谢物L-组胺醇、尿酸、Lyso PE [0:0/20:5(5Z,8Z, 11Z,14Z,17Z)]、8-羟基二十烷四烯酸、20-羟基白三烯B4均表现出正相关，其余代谢物表现出反相关。其中丙酮酸酰基转移酶具有多种生物化学功能和医学应用，可以参与脂肪酸代谢，增加细胞内能量的产生，具有抗氧化的作用，减少自由基的产生，并且可以促进血液循环。LysoPC和LysoPE等代谢物的异常，常常与体内炎症反应呈正相关[33]，而血清代谢组学显示KSG可以回调这些代谢产物。
综合上述实验研究及文献，苦参-蛇床子核心药物组合及其组成药物具有较好抗菌活性，并能通过炎症相关通路蛋白和基因表达调控，发挥对湿疹的治疗作用及护肤活性。KSG对湿疹模型小鼠有明显的治疗作用，推测可能主要通过甘油磷脂代谢通路发挥作用，这就从不同角度对苦参-蛇床子治疗湿疹的多靶点、多途径调控作用进行了诠释，能够为该药物组合防治湿疹的应用提供参考。外用制剂疗效的发挥有赖于有效成分的渗透、吸收、代谢等多个方面，但因中药成分复杂，中药外用制剂量效关系研究涉及原材料、提取方法、涂抹量及涂抹次数等多方面因素[36]。因此，本研究参考前期研究[19]，仅对常规剂量进行了药效考察，其量效关系、相关物质基础有待进一步深入研究。

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主题：【分享】基于数据挖掘与实验验证的抗湿疹中药筛选及活性研究