主题：【分享】基于网络药理学和体外实验探讨淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的作用机制

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发表于：2024/09/13 21:55:58 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

多发性骨髓瘤是一种血液系统恶性肿瘤，其特征是骨髓中存在异常克隆性浆细胞，导致破坏性骨损伤、肾脏损伤、贫血和高钙血症[1]。根据全球癌症观察站的最新数据，全球每年报告的癌症诊断占0.9%，其中有588 161例多发性骨髓瘤病例[2]。研究表明，多发性骨髓瘤患者发病年龄中位数为69岁，大约63%多发性骨髓瘤患者年龄超过65岁[3]。目前我国的多发性骨髓瘤发病率为1/10万～2/10万，而随着我国进入老龄化社会，其发病率将会不断增加[4]。

在过去的几十年中，由于骨髓瘤治疗包括蛋白酶体抑制剂（如硼替佐米）、免疫调节剂（如来那度胺）和自体干细胞移植正在迅速发展，多发性骨髓瘤的预后有了显着改善，但也存在不同程度的不良反应，如血栓风险增加、周围神经病变及过敏反应等[5-7]，往往预后并不理想。然而，多发性骨髓瘤仍是化疗耐药或难治性疾病导致的不治之症。因此，迫切需要寻找新的有效的多发性骨髓瘤治疗药物。

值得关注的是，中医药在提高机体免疫力，发挥“扶正抑瘤”功效方面具有显著优势[8]。中医学认为多发性骨髓瘤属于“骨痹”“骨蚀”“虚劳”范畴，以脾肾亏虚、痰瘀湿毒为主要病因病机[9]。淫羊藿具有温补肾阳、补虚扶正之功效，是中医临床抗肿瘤使用频率较高的一味温阳药，也是抗肿瘤经方中发挥扶正固本功效的重要药味[10]。淫羊藿素是淫羊藿的主要活性成分之一，是淫羊藿苷的水解产物，其具有抗肿瘤、抗骨质疏松以及神经保护等药理作用[11-12]。在多发性骨髓瘤中，淫羊藿素被证明可以抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖并加强细胞凋亡和周期停滞，以抑制多发性骨髓瘤的进展，这表明淫羊藿素在多发性骨髓瘤中发挥抗癌作用[13]。然而，淫羊藿素如何通过复杂的信号网络抑制多发性骨髓瘤细胞尚未明确。

近年来，网络药理学从生物网络平衡的角度为阐明作用机制、发现新靶点、重新定位新适应症提供了有效的研究策略[14]。在本研究中，利用网络药理学和生物信息学手段，探讨了淫羊藿素抗多发性骨髓瘤的潜在作用和机制，为进一步挖掘其潜在的临床应用价值奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 靶点收集
利用SwissTargetPrediction（http://www.swiss targetprediction.ch/）、SEA（http://sea.bkslab.org/）、PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharm mapper/）数据库，以“icaritin”为关键词收集淫羊藿素的作用靶点。通过DisGeNET（https://www.disgenet.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、MalaCards（https://www.malacards.org/）数据库，以“multiple myeloma”为关键词收集多发性骨髓瘤的疾病靶点。再利用Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）统一靶点名称。
1.2 靶点蛋白的互作关系网络构建
利用FunRich软件中Venn分析获得淫羊藿素作用靶点与多发性骨髓瘤疾病靶点的共有靶点，即为淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的潜在作用靶点，并将其导入STRING数据库（https://string-db.org/）获得靶点蛋白之间的相互作用关系，再通过Cytoscape 3.7.2软件构建淫羊藿素与抗多发性骨髓瘤潜在作用靶点的可视化关系网络，获取其中显著相关的关键靶点。
1.3 基因本体（GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析
利用FunRich软件对淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的潜在作用靶点进行GO富集分析，揭示淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组成（CC）。利用KOBAS数据库（http://kobas.cbi.pku.edu. cn/）进行KEGG通路富集分析，揭示淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的关键通路。校正后P＜0.05为显著富集。
1.4 分子对接
首先从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/）下载淫羊藿素的化学结构式文件，然后导入Chem 3D（v15.0）软件生成3D化学结构并使其能量最小化。从RCSB PDB数据库（https:// www.rcsb.org/）下载靶点蛋白的晶体结构文件，使用PyMOL软件去除蛋白结构中的溶剂和有机物，再使用AutoDock（v 4.2.6）软件对蛋白结构进行加氢、计算电荷、添加原子类型。利用Autodock Vina执行淫羊藿素和靶点蛋白的分子对接过程，再通过PLIP分析淫羊藿素和靶点蛋白对接的分子间作用力，最后利用PyMOL软件对分子对接结果进行可视化。
1.5 体外细胞实验
1.5.1 材料与仪器人多发性骨髓瘤U266细胞株（批号W202259481，武汉普诺赛生命科技有限公司）；淫羊藿素（质量分数≥98%，批号YB21577，上海源叶生物科技有限公司）；来那度胺（质量分数99%，批号ML832567，上海麦克林生化科技股份有限公司）；RPMI-1640培养基（含新生牛血清、双抗）（批号2022K1504，江苏凯基生物技术股份有限公司）；PBS缓冲液（批号2022G4202，武汉赛维尔生物科技有限公司）；CCK-8法细胞增殖检测试剂盒（批号2022K9305）、细胞裂解液（批号2022K5202）、BCA蛋白含量检测试剂盒（批号2022K2101）（江苏凯基生物技术股份有限公司）；RNA-easyTM Isolation Reagent（批号Z20228165，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；Evo M-MLV反转录试剂预混液（批号2023AG11706）、SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（批号2023AG21348）（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；DEPC水（批号R20220021，上海碧云天生物技术有限公司）；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（批号P20231203，北京索莱宝科技有限公司）；β-肌动蛋白（β-actin）Rabbit mAb（批号2022AC038）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）p85 alpha Rabbit mAb（批号2022A4992）、蛋白激酶B1（Akt1）Rabbit pAb（批号2022A11016）、HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)（批号2022AS014）（武汉爱博泰克生物科技有限公司）；高敏型ECL化学发光检测试剂盒（批号2022T6152，上海天能科技有限公司）。
超净台、CO2培养箱（美国赛默飞世尔科技公司）；Sigma 2-16K高速冷冻离心机（德国Sigma实验室离心机股份有限公司）；TECAN Sunrise酶标仪（瑞士TECAN公司）；Eppendorf 5810R多功能台式离心机（德国艾本德股份公司）；Roche Light Cycler 480全自动荧光定量PCR系统（瑞士Roche公司）；Bio-Rad Trans-Blot SD型半干转印系统（美国Bio-Rad公司）；Tanon-5200凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。
1.5.2 细胞培养 U266细胞复苏后，待生长至80%～95%融合时进行细胞传代。将细胞悬液转移至15 mL无菌离心管中，200×g离心5 min。弃去上清，加入37 ℃预热的RPMI-1640培养基重悬细胞，按照3×105～5×105个细胞/mL传代比例转移至新的培养皿中，置于温度为37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中继续培养。
1.5.3 实验分组及处理收集生长至对数期的U266细胞，实验组分别用浓度为2、4、8、16、32 μmol/L淫羊藿素处理细胞，对照组加入不含淫羊藿素的培养基，来那度胺组加入含2 μmol/L来那度胺的培养基。
1.5.4 CCK-8法检测细胞增殖抑制率将细胞接种于96孔板，每组3个复孔，每孔细胞数5×104个，培养48 h后，按1.5.3项下分组及处理每孔加入10 μL CCK-8试剂，孵育1.5 h，用酶标仪检测450 nm下的吸光度（A）值，计算各实验组的细胞增殖抑制率。
细胞增殖抑制率＝（A给药－A对照）/A对照
1.5.5 qPCR检测关键基因表达首先使用RNA-easyTM Isolation Reagent提取细胞样品的总RNA，然后使用Evo M-MLV反转录试剂预混液将总RNA逆转录为cDNA，逆转录程序为37 ℃反应15 min，85 ℃加热5 s。使用SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒在Roche LightCycler480全自动荧光定量PCR系统中进行qPCR实验。PCR扩增条件：95 ℃持续30 s；然后95 ℃持续5 s，60 ℃持续30 s进行40个循环。引物序列如表1所示。以β-actin为内参基因，使用2?△△Ct法计算mRNA相对表达水平。
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1.5.6 Western blotting检测关键蛋白表达首先使用细胞裂解液提取细胞样品的总蛋白，并采用BCA法测定蛋白浓度。然后按样本溶液体积与上样缓冲液体积4∶1的比例加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×），99 ℃金属浴加热10 min使蛋白变性，即得最终样品。样品通过10% SDS-PAGE凝胶分离，再转移到硝酸纤维素膜上。在室温下，用TBST缓冲液配制的5%脱脂奶粉溶液封闭2 h后，于4 ℃孵育一抗过夜。然后用TBST缓冲液将膜洗涤3次，并在室温下与1∶2 000稀释的二抗孵育1 h，最后再用TBST缓冲液洗涤3次。使用Western blotting显影液在成像系统中进行化学发光显影，再通过Image J软件对显影的蛋白条带进行灰度分析，从而定量蛋白印迹上条带的灰度值。
1.5.7 统计学分析实验数据以`x ± s表示，多组之间比较采用One-way ANOVA检验进行分析，其中组间两两比较采用Dunnett’s多重比较，数据采用GraphPad Prism软件进行分析。
2 结果
2.1 淫羊藿素、多发性骨髓瘤疾病靶点的获取
利用SwissTargetPrediction、SEA、PharmMapper数据库共筛选得到淫羊藿素作用靶点252个。通过DisGeNET、GeneCards、MalaCards数据库共筛选得到多发性骨髓瘤疾病靶点4 076个。将淫羊藿素作用靶点与多发性骨髓瘤疾病靶点进行Venn分析，见图1，两者共有143个靶点，即为淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的潜在作用靶点。
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2.2 淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的作用靶点分析
将筛选得到的淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的143个潜在作用靶点导入STRING数据库，获得靶点蛋白之间的相互作用关系，再利用Cytoscape 3.7.2软件构建可视化关系网络，见图2，进一步显示出淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的关键作用靶点主要有Akt1、白蛋白（ALB）、连环蛋白β1（CTNNB1）、热休克蛋白90α家族A类成员1（HSP90AA1）、表皮生长因子受体（EGFR）、促分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、酪氨酸激酶受体2（ERBB2）、磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基1（PIK3R1）。
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2.3 GO功能富集分析
如图3所示，淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的潜在作用靶点的GO功能富集分析显示BP主要集中在蛋白质磷酸化、细胞内信号转导等；MF主要集中在蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白结合等；CC主要集中在细胞质、受体复合物等。
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2.4 KEGG通路富集分析
如图4A所示，KEGG通路富集分析显示癌症相关通路、PI3K/Akt信号通路等在淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤中显著富集。各通路之间的相互作用关系网络（图4B）进一步提示了这些信号通路在淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤中的重要调控作用。
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2.5 淫羊藿素与PI3K/Akt信号通路中关键靶点的分子对接验证
如图5所示，将淫羊藿素与Akt1、EGFR、HSP90AA1、PIK3R1、ERBB2、MAPK1进行分子对接分析。结果显示，淫羊藿素可通过氢键、疏水相互作用、π-阳离子相互作用与Akt1结合，亲和力为?8.6 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）；淫羊藿素还可通过氢键、疏水相互作用分别与EGFR、HSP90AA1、PIK3R1、MAPK1结合，亲和力依次为?8.9、?8.4、?7.3、?8.1 kcal/mol；此外，淫羊藿素可通过氢键、疏水相互作用、π-堆积（垂直）作用与ERBB2结合，亲和力为?6.3 kcal/mol。分子对接结果表明，淫羊藿素与重要作用靶点Akt1、EGFR、HSP90AA1、PIK3R1、ERBB2、MAPK1均能有效地结合。
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2.6 不同浓度淫羊藿素对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖的影响
如图6所示，淫羊藿素处理48 h后，U266细胞增殖抑制率升高，且呈浓度相关性。结果表明，采用32 μmol/L淫羊藿素处理U266细胞48 h可较好地抑制细胞增殖。
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2.7 淫羊藿素对U266细胞中PIK3R1、Akt1 mRNA表达的影响
如图7所示，采用32 μmol/L淫羊藿素处理U266细胞48 h后均能显著上调PIK3R1 mRNA表达、下调Akt1 mRNA表达（P＜0.05、0.01）。
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2.8 淫羊藿素对U266细胞中PIK3R1、Akt1蛋白表达的影响
如图8所示，采用32 μmol/L淫羊藿素处理U266细胞48 h后均能明显上调PIK3R1蛋白表达、下调Akt1蛋白表达（P＜0.05、0.01）。
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3 讨论
多发性骨髓瘤是血液系统浆细胞恶性肿瘤，其特征表现为恶性克隆性浆细胞过度增殖，引起骨质破坏以及单克隆免疫蛋白异常分泌，进而导致组织脏器损伤[15]。尽管新的化疗药物以及自体骨髓移植治疗在一定程度上能改善多发性骨髓瘤的疗效，但相应的不良反应及患者的依从性问题仍然存在[16]。因此，亟待寻找治疗多发性骨髓瘤的创新药物。
淫羊藿素是淫羊藿苷的水解产物，已被证明对乳腺癌、肝细胞癌等具有显著的抗肿瘤作用[17]，并且已有用于肝细胞癌治疗的上市药淫羊藿素软胶囊。除了对实体瘤的研究外，淫羊藿素对各种血液癌细胞有显著的抑制作用，包括白血病、多发性骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤[18]。研究表明，淫羊藿素可有效抑制骨髓瘤细胞的增殖，而对正常骨髓细胞的增殖无影响，表明淫羊藿素对正常造血的一般细胞毒性作用较低或没有[13]。因此，淫羊藿素可能突破临床上常规药物的局限性，成为一种有前景的新型候选药物。目前，少有报告描述淫羊藿素的抗肿瘤作用机制，其确切的抗肿瘤作用分子机制尚未表征。因此，本研究拟探讨淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的潜力及可能的分子机制，为深入开发和利用淫羊藿素提供科学依据。
本研究首先利用网络药理学筛选出淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的潜在作用靶点143个，其重要作用靶点主要有Akt1、ALB、CTNNB1、HSP90AA1、EGFR、MAPK1、ERBB2、PIK3R1。GO功能富集分析显示，淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的BP和MF主要集中在蛋白质磷酸化、细胞内信号转导和蛋白激酶活性，而KEGG通路富集分析也显示PI3K/Akt信号通路在淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤中显著富集，这共同提示了PI3K/Akt信号通路在其中的重要调控作用。PI3K/Akt信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，参与很多重要的生物学过程的调控，可通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞增殖和凋亡中发挥关键作用[19]。研究发现，PI3K/Akt信号通路在肿瘤发生中广泛的激活，尤其是PIK3CA、PIK3R1、PTEN、Akt1等基因存在异常表达，与肿瘤发生、发展以及耐药密切相关[20]。由于多发性骨髓瘤细胞与骨髓间充质干细胞相互作用刺激的多种细胞因子可激活PI3K/Akt通路，因此阻断PI3K/Akt已成为一种有前景的多发性骨髓瘤治疗策略[21]。本研究通过分子对接验证也提示，淫羊藿素可能作用于PI3K/Akt信号通路中涉及的重要作用靶点Akt1、EGFR、HSP90AA1、PIK3R1、ERBB2、MAPK1，这进一步提示淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤具有较好的潜力。
研究表明，PIK3R1被认为是一种肿瘤抑制因子，其可以调节癌细胞增殖，已被确定在多种人类肿瘤的癌变过程中发挥重要作用，并与肿瘤进展和转移有关[22]。另外，Akt1也是一种与肿瘤相关的基因，参与了细胞的增殖、分化、存活和代谢等生理过程，其产生的突变或异常表达，可能导致肿瘤生长、转移和耐药性增强等问题[23]。本研究进一步利用人多发性骨髓瘤U266细胞开展体外实验，验证淫羊藿素对U266细胞增殖的抑制作用及对PI3K/ Akt信号通路中关键靶点PIK3R1、Akt1的调控作用。实验结果显示淫羊藿素可较好地抑制U266细胞增殖，并在PI3K/Akt信号通路中显著上调PIK3R1表达、下调Akt1表达。这进一步表明淫羊藿素具有较好的抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的生物活性。
综上所述，本研究首先通过网络药理学和分子对接提示了淫羊藿素治疗多发性骨髓瘤的潜在重要通路PI3K/Akt信号通路及其所涉及的重要作用靶点Akt1、EGFR、HSP90AA1、PIK3R1、ERBB2、MAPK1。进一步通过人多发性骨髓瘤U266细胞实验验证了淫羊藿素可通过调控PI3K/Akt信号通路中PIK3R1、Akt1的表达，抑制多发性骨髓瘤细胞增殖，发挥治疗多发性骨髓瘤的潜在作用。

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