主题：【分享】1H-NMR定量测定黄芪注射液中亲水性成分和疏水性成分

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发表于：2024/09/13 22:06:58 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

黄芪注射液是黄芪经过提取、浓缩、纯化等步骤制备得到的中药注射剂，具有益气养元、扶正祛邪、养心通脉和健脾利湿等作用，临床上常用于心肌炎和糖尿病肾病的治疗[1]。黄芪注射液中所含成分复杂，包括氨基酸、黄酮、皂苷、有机酸和核苷等多类成分[2]，目前，报道的定量分析方法主要针对黄芪注射液中的糖类和皂苷类成分，常用比色法或高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）法分析。比色法用于测定注射液中总糖或者总皂苷的含量，在显色过程中需要用到浓硫酸或高氯酸等强酸试剂[3-4]；HPLC-ELSD方法相较于比色法有较强的特异性，可以测定注射液中少量几个糖或黄芪皂苷的含量[5-6]。这2种方法都需要对样品进行柱色谱预处理。另外还有一些方法，包括固相萃取-高效液相色谱联用（RP-HPLC）、液相色谱-质谱联用（LC-MS-MS），可以对黄芪注射液中一些黄酮类成分定量[7-8]。上述方法均仅针对黄芪注射液中一类成分或单一成分进行分析，大部分化学成分含量未能测得，因此难以全面评价其质量。质子核磁共振（proton nuclear magnetic resonance，1H-NMR）是具有高重现性的非特异性分析技术，在进行混合物分析时，可以采集到混合物中几乎所有含氢化学成分的信息，根据信号强度与对应氢原子数成正比关系，1H-NMR还可对化合物进行定量分析，具有检测速度快、无需随行标曲、非破坏性等优点，因此被广泛应用在新药研发、结构分析和药物质量控制中[9-15]。目前，已有学者应用1H-NMR结合全谱去卷积（global spectral decomposition，GSD）开发了黄芪注射液中8种初生代谢成分定量方法[16]。该方法先将注射液冻干之后用氘代水复溶后进行1H-NMR分析，预处理简单，分析速度快，但是该方法仅针对注射液中的初生代谢成分进行分析，忽视了注射液中的次生代谢产物，分析并不全面。众所周知，中药的次生代谢物是中药有效成分的物质基础，也是质量控制中不可或缺的一部分[17]。为了进一步提升黄芪注射液质量控制水平，本研究开发了一种基于1H-NMR对黄芪注射液中27种成分定量的方法，该方法样品制备简单、实验用时短，可同时定量注射液中糖、核苷、生物碱和皂苷等多类成分，提高了分析效率，扩大了可分析成分范围，为黄芪注射液的质量控制提供了新方法。
1仪器与材料
Bruker Avance III 600型核磁共振波谱仪（配24位自动进样器与5 mm BBO探头，Topspin工作站）、Bruker Avance NEO 500型核磁共振波谱仪（配60位自动进样器与Cryoprobe低温探头，Topspin工作站），德国Bruker公司；AE 200型电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；5425型高速离心机，德国Eppendorf公司；Labconco型冷冻干燥机，美国Labconco公司。
13批黄芪注射液（国药准字Z33020179）由正大青春宝药业有限公司提供，批号分别为2101022、2101033、2103271、2103283、2103302、2109163、2109172、2109191、2109193、2109202、2201173、2201182、2201192，编号分别为B1～B13。3-(3-甲基硅基)氘代丙酸钠（TSP，批号SZBA83XV，质量分数≥99%）、氘代水（D2O，氘含量≥99%）、异亮氨酸（批号P500099，质量分数≥99%）、对苯二甲酸二甲酯（DMT，批号BCBF6171V，质量分数≥99%）、亮氨酸（批号P500105，质量分数≥99%）、缬氨酸（批号P500172，质量分数≥99%）、丙氨酸（批号P500110，质量分数≥99%）、脯氨酸（批号LRAA0931，质量分数≥99%）、γ-氨基丁酸（批号BCCC4017，质量分数≥99%）、焦谷氨酸（批号BCCB9703，质量分数≥99%）、甲酸钙（批号200805，质量分数≥98%）、乳酸（批号SLCK7977，质量分数≥99%）、醋酸钠（批号S30210HHV，质量分数≥99%）、天冬酰胺（BCBH4243V，质量分数≥99%）、富马酸（批号BCBF2132V，质量分数≥99%）、蔗糖（批号WXBD0906V，质量分数≥99%）、苹果酸（批号200603，质量分数≥99%）、果糖（批号WXBD8068V，质量分数≥99%）、琥珀酸（批号C4444685，质量分数≥99%）、丙二酸（批号200420，质量分数≥99%）、半乳糖（批号WXBD9902V，质量分数≥99%）、葡萄糖（批号WXBD7093V，质量分数≥99.5%）、甜菜碱（批号210125，质量分数≥98%）、氯化胆碱（批号210520，质量分数≥98%）、盐酸葫芦巴碱（批号211205，质量分数≥98%）、尿苷（批号SLCB8621，质量分数≥99%）、腺嘌呤（批号WXBD1877V，质量分数≥99%）、黄芪皂苷III（批号200728，质量分数≥98%）、黄芪甲苷（批号200802，质量分数≥98%）、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-葡萄糖苷（批号200903，质量分数≥98%）、毛蕊异黄酮苷（批号200923，质量分数≥98%）、腺苷（批号WXBD0809V，质量分数≥99%）、芒柄花苷（批号200921，质量分数≥98%）、胞苷（批号BCCB521，质量分数≥99%）、异黄烷苷（批号200326，质量分数≥98%）、鸟苷（批号BCCB9660，质量分数≥98%）以及用于方法学考察的氨基酸、核苷类、糖类化学对照品以及DMT、TSP和富马酸购自美国Sigma-Aldrich公司；含0.03%四甲基硅烷（TMS）的氘代甲醇（CD3OD，氘含量≥99.8%）购自美国剑桥同位素实验室有限公司；醋酸钠购自天津希恩思生化科技有限公司；琥珀酸购自上海麦克林生化科技有限公司；其余对照品均购自上海融禾医药科技有限公司；去离子水由纯化水系统Milli-Q Synthesis（美国Millipore公司）制备得到。
2 方法与结果
2.1 样品的制备
2.1.1 亲水性成分1H-NMR样品的制备准确量取540 μL黄芪注射液与60 μL D2O（含内标TSP 0.29 mmol/L），混合均匀后转移至5 mm标准核磁管，以待分析。
2.1.2 疏水性成分1H-NMR样品的制备准确量取黄芪注射液1 000 μL冷冻干燥后，加入CD3OD（含内标DMT 1.0 mmol/L）600 μL，混合均匀后转移至5 mm标准核磁管，以待分析。
2.2 1H-NMR仪器参数
使用Bruker Avance III 600型核磁共振波谱仪记录所有样品的1H-NMR图谱，频率为600.27 MHz。首先，使用经典的溶剂压制脉冲ZGPR用于优化发射机频率偏移（O1）的参数，使水信号压制达到最佳效果。优化结果为，亲水性成分分析时O1为2 816.65 Hz，疏水性成分分析时O1为2 930.31 Hz。之后采用Noesygppr1D脉冲序列获得1H-NMR图谱，具体采集参数如下：温度为298 K，数据点32 K，脉冲宽度（SW）7 211.54 Hz，采集时间（AQ）2.980 s，90°脉冲宽度14.75 μs，混合时间0.05 s，为了使成分和内标的信号峰均弛豫完全，分析亲水性成分和疏水性成分的弛豫延迟时间（D1）分别为15.0 s和20.0 s；接收器增益（RG）为57，扫描次数（NS）32次。
2.3 数据分析方法
所有样品的1H-NMR谱图在软件MestReNova（version 14.2.1）和Bruker Topspin（version 4.1.4）中进行处理。傅里叶变换之前，以0.30 Hz的指数函数为的窗函数对原始数据进行处理。在Bruker Topspin软件中进行手动相位校正后，以TSP信号（0.00）或TMS信号（0.00）为参考进行化学位移对齐处理。在进行化学成分特征峰归属之后，使用MestReNova软件中的线性拟合模块进行半自动积分。最后，应用内标法对各高于定量限的化学成分进行定量，按式（1）进行计算。
Cx＝AxNsMxCs/AsNxMs （1）
Cx和Cs分别是待测化学组分和内标的质量浓度，Ax和As分别是待测化学组分和内标的特征峰面积，Nx和Ns分别是待测化学组分和内标的特征峰质子数，Mx和Ms分别是待测化学组分和内标的相对分子质量
2.4 1H-NMR图谱信号归属与定量峰选择
利用上述的分析方法得到黄芪注射液的1H-NMR全谱，通过文献检索注射液中可能存在的成分，在比对对照品图谱之后加标验证的方法[2,16,18]，从图谱中归属出33个成分，归属结果如图1所示，包括7种氨基酸（异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、焦谷氨酸、天冬酰胺、脯氨酸），8种小分子有机酸（乳酸、甲酸、乙酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸、丙二酸、γ-氨基丁酸），3种生物碱（甜菜碱、胆碱、葫芦巴碱），4种糖（蔗糖、果糖、半乳糖、葡萄糖），5种核苷类成分（尿苷、腺苷、胞苷、鸟苷、腺嘌呤）以及6种黄芪皂苷/黄酮苷类成分（黄芪皂苷III、黄芪甲苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、异黄烷苷），以上24种初级代谢产物和9种次级代谢产物均为黄芪药材中固有的成分或这些成分在生产过程中转化出来的成分[19-20]。由于直接在注射液中加入D2O制样时，黄芪皂苷/黄酮苷类成分等疏水性成分的信号非常弱（图1-B），因此，将注射液冻干后使用CD3OD复溶再制样分析，随着取样量增加，疏水性成分的信号强度变大，利于观察和后续进一步定量。
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归属出的33个化学成分中，有7个成分无法定量。其中，亮氨酸信号重叠严重，无可以积分的独立信号；胞苷、半乳糖、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-葡萄糖苷、异黄烷苷信号较弱无法积分定量。如图2所示，进行疏水性成分1H-NMR分析时，发现注射液图谱中黄芪皂苷III的信号强度非常低，基本淹没在噪声中；黄芪甲苷在δH 0.25和δH 0.59处的信号，信噪比较低，在δH 1.02和δH 4.30处的信号存在重叠，这些信号均无法用于定量。参考文献发现，有学者使用人参皂苷类成分共有的信号峰对人参总皂苷进行定量[13]，所以，本研究选择黄芪甲苷和黄芪皂苷III在δH 1.12处的共有信号，对该信号进行3次手动积分，取平均值后计算二者的总物质的量。黄芪甲苷、黄芪皂苷III的相对分子质量均为784.97，因此，开发的定量方法可以得到两者的总质量浓度。本研究开发的1H-NMR方法可对黄芪注射液中的27个化学成分进行定量，定量峰的选择结果如图3及表1所示。
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2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验取同一批次（批号2109172）的黄芪注射液，按“2.1”项下的方法制备1份供试品溶液，并按照“2.2”项中的条件连续分析6次，精密度考察结果如表2所示，RSD为1.54%～2.93%，这说明仪器精密度良好。
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2.5.2 重复性试验取同一批次（批号2109172）的黄芪注射液，按“2.1”项下的方法制备6份供试品溶液，并按照“2.2”项中的分析条件分析，结果如表2所示，RSD为1.53%～3.15%，这说明制样重复性良好。
2.5.3 稳定性试验取同一批次（批号2109172）的黄芪注射液，按“2.1”项下的方法制备1份供试品溶液，在0、6、12、24、36、48 h分别按照“2.2”项中的条件采集1H-NMR图谱，结果如表2所示，RSD为0.88%～3.43%，这说明供试品溶液在48 h内稳定性良好。
2.5.4 耐用性试验取同一批次（批号2109172）的黄芪注射液，按“2.1”项下的方法制备1份供试品溶液，分别在296.5、297.0、297.5、298.0、298.5、299.0 K 6个温度点下，按照“2.2”项中的条件进行分析，结果如表2所示，RSD为1.50%～2.92%，这说明方法的温度耐用性良好。
取同一批次（批号2201091）的黄芪注射液，按“2.1”项下的方法制备1份供试品溶液，分别在600型和500型2台核磁共振谱仪下，按照“2.2”项中的条件进行分析，对2种方法的定量结果进行回归分析，相关系数为0.999 9，这说明在这2台不同型号的仪器分析结果一致。
2.5.5 线性关系考察精密移取黄芪注射液（批号2201091）200、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600 μL各2份于安瓿瓶中，冷冻干燥挥干溶剂后，1份加入600 μL的D2O（含内标TSP 0.29 mmol/L），另1份加入600 μL的CD3OD（含内标DMT 0.29 mmol/L），复溶后转移入5 mm核磁管，按“2.2”项下的方法进行分析，并计算质量浓度，以样品相对质量浓度为横坐标，计算得到的质量浓度为纵坐标进行线性回归，得到各成分的线性回归方程和线性范围，结果如表2所示，所有成分线性回归方程截距接近0，相关系数（r2）为0.999 0～0.999 8。
2.5.6 加样回收率试验取已知含量的黄芪注射液（批号2201182），分高、中、低3个质量浓度组加入定量的对照品，而后按“2.1”项下的方法进行含量测定，并计算各化学组分的加样回收率，结果如表2所示，平均加样回收回收率在98.19%～101.40%，RSD小于1.31%。
2.6 13批样品测定结果
取13批黄芪注射液，按“2.1”项下的方法制备样品，并按照“2.2”项中的条件分析27种化学成分的含量，具体结果如表3所示，整体上看，无论是糖类成分、氨基酸、有机酸或是核苷类成分，B9和B11这2批黄芪注射液中含量均显著高于其他批次，而B5和B7这2批黄芪注射液中各类成分的含量显著低于其他批次。黄芪注射液中含量较高的成分有蔗糖、果糖、葡萄糖、脯氨酸和黄芪甲苷，其中蔗糖含量最高可达18.05 mg/mL，这4批黄芪注射液均为2021年3月至2022年1月之间生产，注射液生产时间较为接近，推测可能是药材差异引起的含量差异，也可能是工艺环节一致差，如醇沉工艺包裹沉淀量不同导致的批次间质量一致性差。
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为了直观地观察到13批黄芪注射液样品的异同，以27个化学成分浓度为变量，以13个批次为观测值，应用主成分分析（principal component analysis，PCA）法从全面化学成分角度分析不同批次黄芪注射液的相似性与差异。PCA模型中有3个主成分（PC1 70.3%、PC2 13.8%、PC3 6.7%），RX2为0.903，Q2为0.658。将PCA得分值和载荷值共同绘制成双标图（biplot），同时呈现了变量与观测值的分布，从而根据化合物浓度来解释样品批次的异同。位于样品批次附近的化学成分在这些样品中浓度较高，而在另一侧的成分在样品中浓度较低。靠近绘图原点的样品具有平均属性，接近绘图原点的变量对相关分数的形成没有贡献。
PCA模型的双标图及得分贡献图如图4所示。大多数化学成分所对应的变量集中在中轴线的右侧，B9、B11 2批黄芪注射液与这些变量的相对距离最近，说明在这2批黄芪注射液中这些成分的含量均较高，这与测定结果一致。乳酸、琥珀酸分布于图表的上端，距离这些变量较近的黄芪注射液批次为B1，较远的批次为B7，这说明B1批次黄芪注射液中这2个成分的含量相对于B7更高。而距离B1较远的一些变量所对应的成分为苹果酸、γ-氨基丁酸，这2个成分在B1中含量较低。得分贡献图所展示的是不同成分对于样品间差异的贡献得分，其中贡献最大的是琥珀酸、乳酸和γ-氨基丁酸，另外，黄芪皂苷和毛蕊异黄酮苷这些次级代谢产物对于样品差异也具有较大贡献。
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为测试1H-NMR的分析能力，取一批黄芪注射液利用干燥恒重法测定了总固体含量，应用离子色谱法和电感耦合等离子体-质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）法分别测定黄芪注射液中阴、阳离子的含量，应用1H-NMR测定黄芪注射液中各类成分含量，计算了每类成分在总固体中所占的比例（成分含量/总固体含量），结果见表4。1H-NMR一次分析可对黄芪注射液中90%以上的成分定量，加上离子所有可测成分的含量占总固体含量的比例超过95%。
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2.7 HPLC和1H-NMR比较
为了进一步考察1H-NMR方法的准确性，将本研究开发方法与参考方法进行比较，目前文献中报道的关于黄芪注射液成分定量的方法多针对黄芪甲苷和毛蕊异黄酮苷，因此，本研究采用文献报道的HPLC-UV-ELSD方法[21]分析了5批次黄芪注射液中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮苷的含量，与1H-NMR的测定值进行比较，结果如表5所示，对2种方法的定量结果进行回归分析，黄芪皂苷和毛蕊异黄酮苷结果的相关系数分别0.998 9和0.997 3，这说明2种分析方之间存在良好的一致性，这也进一步证实了NMR方法的准确性。
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3 讨论
本研究开发了一种基于1H-NMR对黄芪注射液中化学成分定量的方法。该方法可以对黄芪注射液中27种成分进行定量，包括8种小分子有机酸、6种氨基酸、4种核苷、3种糖、3种生物碱以及3种皂苷和黄酮类成分，可定量的成分占总固体量90%以上。相较于传统的定量方法如比色法、HPLC等，预处理操作涉及强酸试剂[22]或萃取[23]等复杂步骤，本研究开发的方法前处理操作仅包括冷冻干燥。此外，该方法分析时间短，仅需15 min即可完成一次分析，且不需要随行标曲。本研究还成功将开发的方法应用到13批黄芪注射液中的化学成分定量分析中，并全面展现批次间的差异。本研究开发的1H-NMR方法具有操作简单、分析快、结果可靠等优点，为黄芪注射液质量控制提供了新的分析手段。

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