主题：【分享】基于网络药理学和分子对接的逍遥散治疗肝癌并抑郁症的潜在机制探讨

原发性肝癌起源于肝细胞或肝内胆管上皮细胞，是一种恶性肿瘤疾病，其中肝细胞癌的患病率尤为显著［1］。据统计，我国肝癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中分别排在第5位和第2位［2］，严重威胁国民健康。此外，肝癌患者中发生抑郁的比例较高［3］，而抑郁症是一种精神障碍性疾病，其他疾病一旦并发抑郁症则复发风险增加，严重程度和死亡率更高，增加了治疗成本和持续时间，加重经济负担［4］，故探索出有效治疗肝癌并发抑郁症的方案十分迫切。
研究表明，源自古代《太平惠民和剂局方》的经方逍遥散，由柴胡、茯苓、白芍、当归、甘草、白术、薄荷、生姜8味药材组成［5］，可治疗多种疾病，陈士铎等明清名医认为其主治“五郁”，并具有广泛的适用性，可灵活搭配用于治疗各种内伤杂症［6］，而抑郁症中以肝郁脾虚型最常见［7］。本课题组总结前期研究，表明肝癌患者亦是以此证型最常见，加上近年来有不少逍遥散类方治疗肝癌的研究，表明逍遥散和简化方均具有保肝作用，不仅能够有效降低丙氨酸氨基转氨酶（ALT）和天冬氨酸氨基转氨酶（AST）水平，提高抗氧化水平，减轻药物引起的肝毒性［8］，还可抑制炎症因子，下调神经内分泌激素表达，抑制肿瘤的生长［9］以及抗脂质作用［10］。
本研究主要通过网络药理学整体阐释复方中药的作用机制［11］，结合分子对接进一步验证分子层面机制，挖掘出逍遥散对肝癌并抑郁症的作用机制，阐释逍遥散更加全面有效的临床实践科学内涵，为中医药尤其是中医复杂理论的现代化研究提供实验依据。
1　资料与方法
1.1　成分收集与筛选
运用中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以逍遥散组方中药的“柴胡”“茯苓”“白芍”“当归”“甘草”“白术”“薄荷”“生姜”为检索词，以口服生物利用度（OB）＞30%及类药性（DL）＞0.18为筛选条件，获取组方中药的有效成分［12］，通过有效成分MOL ID获取相应靶点，并将其对应的Target name导入STRING数据库标准化处理靶点名称。
1.2　肝癌及抑郁症疾病靶点收集
通过GeneCards数据库（http：//www.genecards.org/）搜索疾病靶点，其中肝癌以相关简写（PHC、PLC、HCC）、抑郁症以简写MDD为检索词获取相关疾病靶点。
1.3　蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建
将筛选得到的逍遥散药物靶点与肝癌、抑郁症相关的疾病靶点进行重叠分析，以获取共同靶点，保存为逍遥散及肝癌-抑郁症共同交集靶点文件，并通过STRING数据库预测PPI互作关系，通过在线作图工具绘制韦恩图［13］，再利用Cytoscape 3.9.1软件进行可视化处理。
1.4　逍遥散成分-靶点网络构建
将逍遥散的全部活性成分和靶点导入Cytoscape3.9.1，进行网络分析，并绘制成分-靶点相互作用图，节点代表药物成分和靶点，边则代表二者的相互作用。
1.5　基因本体（GO）注释及京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析
将交集靶点导入DAVID数据库进行GO、KEGG分析，以揭示其生物学意义，并使用微生信平台绘制GO和KEGG富集分析柱状图。
1.6　分子对接验证及筛选
选择度值排名前10的核心交集靶点为受体，度值排名前10的活性成分为配体进行对接［14］。通过Pubchem数据库获取成分的3D结构并借助Discovery Studio Visualizer软件将10个受体合并为一个文件，命名为LIG-，并保存为MDL MOL/SD File格式，从PDB数据库中获取蛋白晶体结构数据，随后借助PyMOL软件进行处理，以清除水分子和杂质，分别将各个处理后的靶点分别导入AutoDock Tool1.5.7软件中加氢键并保存为PBDQT文件，使用PyRx和PyMOL进行分子对接与可视化展示。
2　结果与分析
2.1　逍遥散活性成分及靶点
筛选得到逍遥散活性成分共161个，其中柴胡活性成分17个，当归活性成分2个，白芍活性成分13个，茯苓活性成分15个，白术活性成分7个，生姜活性成分5个，薄荷活性成分10个，甘草活性成分92个，对以上中药活性成分进行靶标预测，导入STRING数据库进行Target name标准化处理共得到661个靶点，去重后最终得到238个靶点。
2.2　疾病靶点的筛选与PPI网络的构建
通过GeneCards数据库获得肝癌疾病靶点10 227个、抑郁症疾病靶点977个，将二者靶点和逍遥散靶点取交集，得到69个交集靶点，并制作韦恩图（图1）。

借助STRING数据库，构建交集靶点的PPI网络图（图2），并将其导入至Cytoscape 3.9.1进行优化，此图共含69个节点，918条边，根据度（degree）值进行升序排列，越靠近圆圈内部代表度值越高，核心靶点根据度值筛选，前10名依次为：肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素1b（ILIB）、白细胞介素6（IL6）、苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、雌激素受体1（ESR1）、凋亡抑制基因（BCL2）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、肿瘤蛋白p53基因（TP53）、缺氧诱导因子1a（HIF1A）、信号传导和转录激活因子3（STAT3）。这些关键靶点可能为逍遥散治疗肝癌并发抑郁症的关键靶点。

2.3　药物活性成分-靶点网络的构建
将逍遥散的活性成分及靶点数据导入Cytoscape 3.9.1软件，在Cytoscape软件中的“Apps”选择插件Centiscape 2.2中，同时选中“度值”“介度”“紧密度”后进行网络分析，得到该网络的度值为4.22、介度为662.34、紧密度为0.001 1，以大于以上三者的值为筛选标准，最终得到逍遥散的主要活性成分-靶点网络，该网络包含了271个节点（其中包含39个活性成分和232个靶点及572条边），并选取OB值排名前20的活性成分进行展示（表1），随后又依据度值从小到大的顺序，构建逍遥散活性成分与靶点间的相互作用图（图3），图中内部圆圈矩形排列为所有靶点，外围环绕各三角形图代表所有活性成分，图形形状越大代表度值排名越靠前，结果显示逍遥散中度值排名前10的活性成分为异鼠李素、堪非醇、苜蓿毒素、β-谷甾醇、豆甾醇、毛地黄黄酮、茵陈黄酮、山槐素、3β-乙酰氧基苍术酮、熊竹素。

2.4　GO富集分析
采用DAVID数据库进行69个交集靶点的GO富集分析，得到生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）共607条GO条目（P＜0.05）。其中BP相关条目471条，包括基因表达的正调控、信号转导、以DNA为模板的转录调控、炎症反应调节、基因表达抑制等。MF相关条目88条，包括相同的蛋白质、酶、血红素结合，蛋白质同源二聚化、细胞因子活性等。CC相关条目48条，P值靠前的包括细胞外间隙、胞外区、大分子配合物、突触后膜的整体成分、突触前膜的整体成分等。利用微生信在线工具对BP、CC、MF前10条通路制作GO富集柱状图（图4）。

2.5　KEGG富集分析
富集分析共获得143条KEGG功能条目（P＜0.05），最终取前20条通路制作KEGG富集柱状图（图5），结果显示基因主要富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、恰加斯病、癌症、HIF-1等信号通路。此外，发现IL6、BCL2、STAT3、AKT1等关键靶点在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路和HIF-1信号通路中均显著富集，见表2。

2.6　“中药-成分-靶点-疾病-通路”网络选择KEGG排名前20条通路与逍遥散、肝癌、抑郁症及三者的交集靶点及对应的成分导入Cytoscape构建网络图，见图6和表3。

2.7　分子对接结果
通过分子对接验证度值排名前10的核心靶点与活性成分之间的亲和度。结果表明，活性成分β-乙酰氧基苍术酮与靶点BCL2、IL6、ESR1、IL1B、STAT3、AKT1的对接结合能低于-20.9 kJ·mol-1，结合活性较好；与TP53、PTGS2、TNF、HIF1A结合能均低于-29.3 kJ·mol-1，结合活性强，说明靶点和活性成分之间能稳定结合［15-16］，具体结合能数据见表4，并构建β-乙酰氧基苍术酮与关键靶点分子对接模式图（图7），显示β-乙酰氧基苍术酮分别与TP53在LYS-1516、ASP-1526位点形成氢键；与PTGS2在GLN-461、HIS-39位点形成氢键；与TNF在THR-139、ASN-135位点形成氢键；与HIF1A在SER-148、ARG-89位点形成氢键；与BCL2在GLN-190、ARG-6位点形成氢键；与IL6在SER-108、THR-44位点形成氢键；与ESR1在HIS-3、TRP-195位点形成氢键；与IL1B在SER-43、ASN-7、GLU-64位点形成氢键；与STAT3在ASN-315、GLN-232位点形成氢键；与AKT1在ARG-15、THR-87位点形成氢键。

3　讨论
中医学认为，原发性肝癌属“癥瘕”“积聚”“鼓胀”“肝积”等病范畴［17］，而抑郁症的主要症状为肝郁［18］，是一种常见于癌症、糖尿病等慢性疾病患者的共病［19］，二者可互为因果，相互影响。
而经典方剂逍遥散方中以柴胡为君药，发挥着疏肝解郁的关键作用；当归和白芍则协同养血柔肝，共为臣药；茯苓、白术健脾益气，生姜温胃和中，薄荷则协助柴胡疏理肝气，四者同为佐药；甘草不仅发挥着调和诸药的关键作用，还具备健脾益气的效果，因此作为佐使之用。以上8味药物相互协作，共同发挥疏肝理气、养血健脾的治疗效果［20］。因此逍遥散不仅能够治疗抑郁症，同时其组方中大多化合物对肝癌均具有靶向作用，比如君药柴胡的主要活性成分柴胡皂苷，在体内外均展现出显著的抗炎、抗肿瘤、抗病毒以及保护肝脏的活性作用［21-23］。
本研究通过网络药理学以及分子对接验证了白术的主要成分3β-乙酰氧基苍术酮与核心靶点结合力强，研究表明该成分通过PI3K/Akt、IL-17等信号通路作用于MAPK1、TP53、ESR1，调节神经生理过程和神经细胞的生理功能［24］，并具有很强的穿透血脑屏障的能力，直接作用于大脑，还能调节IL-6、一氧化氮合酶3（NOS）、ESR1和TNF水平［25］，缓解炎症并抑制细胞凋亡［26］，发挥抗抑郁、抗肿瘤作用。
同时度值排名靠前的核心交集靶点中大部分为炎症因子，文献表明炎症因子与肝癌［27］、抑郁症发生密切相关，比如TNF-α和IL-6是两种常见的炎性细胞因子，参与抑郁症的神经炎症反应［28］，和抑郁严重程度呈正相关［29］，抑郁症急性发作期间，IL-6、TNF-α水平显著升高［30］。TNF-α还通过将Caspase-3与死亡域蛋白（FADD）结合来诱导细胞凋亡［31］，发挥抗肿瘤作用。上调Bcl-2基因表达可改善抑郁症状［32］，而Bcl-2表达下调，Bcl-2相关X蛋白（Bax）水平上调可诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡［33］。低HIF-1α血浆水平与肝癌更好的治疗反应和较高的总生存周期显著相关［34］，以及与NF-κB、STAT3一起影响炎症的发生［35］，还能引起抑癌基因p53基因发生突变，参与铁死亡调控［36］，影响肝癌的发展［37］。而ESR1则通过调节5-羟色胺（5-HT）信号传导［38］，改善抑郁症状。综上表明，核心交集靶点在炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发展等方面发挥重要作用，进一步揭示了其在肝癌和抑郁症发病机制中的关键角色。
通过KEGG富集发现，富集最显著的AGEs-RAGE信号通路激活能介导炎症反应，促使炎症因子，如TNF-α、IL-6等分泌增多，而炎症因子的高表达状态又能反向调节AGEs-RAGE轴，抑制下游NF-κB信号通路的活化，从而减少多种炎症介质的产生与释放，进而减轻机体的炎症反应［39］，参与脑组织损伤过程［40］。缺氧状态下，还可诱导AGEs-RAGE介导的HIF1α活化、NF-κB、ERK和Akt信号通路影响癌症的进展［41］。比如，AGEs通过ERK途径诱导自噬，下调RAGE降低自噬和肿瘤细胞的存活，进而导致凋亡细胞的死亡［42］。AGEs与其细胞结合的AGE受体（RAGE）的相互作用增加了氧自由基的产生、激活NF-κB［43］，造成炎症细胞因子与活性氧产生，引发炎症与免疫抑制［44］，加速形成的衰老蛋白衍生物［45］，介导肿瘤细胞与其微环境成分之间的关联，以诱导缺氧、线粒体功能障碍、内质网应激、自噬、表观遗传修饰和癌症干性［46］，调控细胞增殖、分化、死亡、炎症、免疫［47］，进而发挥抗肿瘤、抗抑郁功效。
中药方剂为复杂网络，其特点是多组分组合，并通过多层次、多靶点发挥综合效应，使机体恢复生物网络平衡［48］。本研究通过网络药理学和分子对接验证，逍遥散主要通过活性成分3β-乙酰氧基苍术酮等介导IL6、TNF、BCL2、HIF等靶点，调控AGEs-RAGE和HIF-1信号通路等，发挥抑制炎症、免疫调控、促进细胞凋亡等作用，从而改善肝癌并抑郁症的临床症状。