主题：【分享】非线性色谱之柱效与对称性

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发表于：2024/10/27 18:06:15 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

南京元宝山色谱

随着生物医药行业的发展，色谱作为药物分析和纯化的高效手段应用日益增多，色谱柱分离能力的优良，是决定着原料药最终纯度的关键性因素，其中就包括我们今天要提到的柱效与对称性，是色谱柱好坏的重要衡量的参数。对于分离纯化来说，高柱效一定意味着高载量吗?

柱效：是用于描述色谱柱提供窄峰（narrow peaks）的相对能力，它用塔板数N来定义。理论塔板数（N）是衡量峰尖锐度的一个通用指标，也是固定相对分析物保留以及分析物分离有效性的指标。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用标样的性质。

在色谱峰符合正态分布时，柱效可近似成下方的计算公式：

色谱柱长：L

虚拟的塔板间距离：H

色谱柱的理论塔板数为N

保留时间: t_R

半峰宽: W_h/₂

测定柱效时怎么选择最佳流速？最佳的流速代表着最好的柱效，最好的柱效代表着最佳的分离效果，所以需要寻找一个最佳的流速或流速范围来实现最好的分离。此关系可参考下面的方程

根据Van Deemter方程：

H = A + B/u +C·u

也称为速率理论得出:

涡流扩散A与流速无关

纵向分子扩散B/u与流速成反比

两项传质阻力Cu与流速成正比

不同颗粒大小的填料最佳的流速范围均不一致，由下图可看流速在一定区间内会得到最小的H,由于N=L/H，所以可得出N最大，也可看出填料孔径越小最佳流速范围越宽泛。

其他的最佳数值可参考往期-制备色谱之柱效测试知多少进行了解。

对称性：理论上讲，色谱峰应符合高斯曲线分布，然而实际上任何色谱峰都对高斯曲线分布存在一定的偏离，亦即不对称。峰拖尾可以用不对称因子(As)或USP拖尾因子(Tf)来衡量（对称性可认为是口语上的一种称呼），显然不对称因子的说法更准确，因为色谱峰存在前延、对称、拖尾三种形态。一般来说，制药行业以USP拖尾因子作为评测标准，而其他行业则多采用As来测定峰形。

对于药物分析，通常有明确的规定，Tf应处于某一范围之间，比如我国药典规定某些药物的拖尾因子应处于0.95~1.05之间。其他行业尚无较为明确的规定。

　　拖尾因子是美国药典规定用于评价峰形对称性的一个参数，其计算公式为Tf=(A+B)/2A。拖尾因子的计算公式中A和B的数值如图所示，从色谱峰的顶点作一条直线与基线垂直，再于峰高5%处做一条与基线平行的直线，与垂线相交于O，与峰的两边分别相交于点a和b，以A表示oa的长度，以B表示ob的长度。

　　不对称因子的概念与拖尾因子接近，两者的区别主要是有两个：1)计算公式不同As=B/A;2)用于计算的A和B的取值方位不同，不对称因子是以峰高10%处来计算的。下图可清楚说明他们之间的关系。

图为拖尾因子与不对称因子的区别与联系。

　　拖尾因子：Tailing factor常用Tf表示，以峰高5%处计算;

　　不对称因子：Asymmetry factor常用As表示，以峰高10%处计算;

　　对称因子：Symmetry factor常用S表示，与不对称因子As互为倒数关系。

对于非线性色谱柱效及对称性就代表着分离纯化能力的高低。同一款填料，如果能装出高柱效，肯定有利于更高的载量和收率。对于不同品牌的填料或不同类型的C18，高柱效不一定比得过好的选择性和分辨率，还是找到分的更开的填料类型更重要。填料生产工艺和品质决定了色谱柱柱效和对称性的标准，而对于我们设备供应商而言就是如何运用最恰当的装柱方法和测试方法更加完美的展示填料的分离能力。