主题：【华山论剑第九集】如何更好的建立质谱方法？

我们的是ABI 4000Q，主要做定性，定量分析。

方法学开发的一般步骤是
1.微量注射泵获得母离子和子离子以及DP CE这四个主要参数
2. 根据化合物性质确定大致的流动相组成。
3. 利用FIA优化其他参数，主要是气体参数和TEM IS。

原文由 dickwang2008 发表:
我们在使用液质联用仪时，最重要的是建立质谱方法，那么大家是如何建立更好的质谱方法？你们在应用直接进样时，是利用注射泵进样还是六通阀直接进样（可以按仪器分类）？这两种进样方式有什么优缺点？欢迎大家参与讨论！

六通阀直接进样不必停止流动相的流动，进样的体积是由定量管的体积严格控制的，所以进样准确，重现性好，适于作定量分析．更换不同体积的定量管，可调整进样量．也可以用较大体积的定量管进少量试样，进样量由注射器控制，试样不充满定量管，而只是填充其一部分的体积．

我们一般是用注射泵进样摸质谱条件的,这样能排除柱子的干扰.

我见到的大部分都是用泵进样，利用注射泵进样直接方便，速度快，可快速优化各个参数
但碰到难冲洗的化合物，基线不容易降低。 用六通阀直接进样的优点是基线容易走低，但是比较耗时，操作较繁琐，对仪器操作者有要求。

我见到的大部分都是用泵进样，利用注射泵进样直接方便，速度快，可快速优化各个参数
但碰到难冲洗的化合物，基线不容易降低。 用六通阀直接进样的优点是基线容易走低，但是比较耗时，操作较繁琐，对仪器操作者有要求。

建立一个SRM Transition 534 → 375



一个定量分析方法应该是特征性的、高准确度和高灵敏度的。在不牺牲上述特性的前提下，建立方法应该尽可能地快速，质谱定量可以很好地满足这些规则。

在建立一个感兴趣的化合物的MS/MS碎片transition的时候，一种优化transition的方法是用注射泵进样（syringe pump）该化合物来优化。

先在全扫描方式中优化母离子信号。因为MS/MS的灵敏度将依赖于化合物在全扫描模式中是否响应得好，要尽可能地优化全扫描的、非CID响应的MS信号。

然后优化碰撞能CE和碰撞气体，给出丰度最高的碎片离子。不能使用太大的碰撞能CE，因为太大的CE会丢失稳定的、有价值的碎片峰。“我应如何优化碎片峰？”可以用注射泵进样化合物，进行MS/MS，挑出一个稳定的碎片峰，当改变碰撞能和碰撞气体参数时监测它的离子流。最后当获得最大的碎片离子峰响应时确定碰撞能和碰撞气体参数。现代的三重四极杆质谱都可以自动优化。

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从优化好的MS/MS谱中，选择一个合适的碎片峰用于定量监测。如图A所示，母离子质量为534，似乎从图B中可以很容易选择一个碎片峰做Transition。一个基本考虑是尽可能不要选择离母离子太近的质量。非常常见的，是化合物的失水峰或失氨（ammonia）峰，例如：534－517＝17。我们应尽可能不要选择失水峰或失氨（ammonia）峰做SRM，因为这会导致一个不是很特异的transition。这里，Transition 534 → 375是一个好的选择。另外要注意的是：要选择一个稳定的峰。当直接进样化合物时，被选择做Transition的峰必须每次扫描响应都一致。

提示：当优化MS条件时，最好能模拟实际做样的条件。例如：实际做样时色谱流速是400 ul/min，化合物在30%有机相时流出，用注射泵进样优化MS条件时最好模拟这个条件，即设置HPLC流速为400 ul/min，30%有机相；然后用三通注入化合物。

同时，第一次优化实验时，我们可以选择60/60的梯度，去表征化合物的疏水性，从而得知它在C18反相柱上的色谱行为。如果你对所有的化合物都按这样的方法实验，你就可以建立一个洗脱数据库，可以作为将来实验的参考。

注： 60/60梯度的意思是：梯度从近100% 水相开始，在60分钟内到达60%有机相。

液相色谱串联质谱联用药代动力学方法开发



更快就是更好！在每一个药代动力学分析中更快就是更好！

样品组/系列包括：重复的标准品，QC质控样品，和样品，加起来大概要进行300次分析。如果每个样品实验耗时15分钟，整套分析要75个小时。高要求的实验（加上质谱）总计要超过3天时间。一些该领域的研究者可以只花1～2分钟分析一个样品；而大多数的PK/MS的实验室一般很容易做到花3～4分钟分析一个样品。如果对上面同样的300个样，4分钟一个实验的话，总分析时间可减少到20个小时。所以，每分钟都是很重要的！在2mm× 30～50mm反相短柱上可以获得快速的梯度和快速的平衡时间。LC/MS的非药动实验中，流速一般为200 µl/min.，而在LC/MS的药动实验中，流速一般设为400 ～ 1000 µl/min。更快的流速有助于加速洗脱和平衡。下面是典型的LC/MS药动实验条件：

LC/MS药动实验方法：

色谱柱：2.1 X 50 mm, 5 µm , 100 Å , C18
柱温： 40℃
流动相：A 为水相（0.1% 甲酸），B为乙睛（0.1%甲酸）
流速： 400µl/min
梯度： Time(min.)　　　　%B
　　　　　0　　　　　　　　25
　　　　　2　　　　　　　　80
　　　　　2.1　　　　　　　25
　　　　　4　　　　　　　　25
Notes：
a ) 调节初始的％B使其适应该化合物
b ) 试着减少梯度时间到1分钟以缩短方法时间

优化梯度：

当然你要对每个化合物特别的进行方法优化。我们推荐创建一个色谱数据库，详细地记录实验室接手的各个化合物的疏水性（可以运行60/60方法完成）。当你需要挑选一个相似疏水性的内标时，这样的色谱数据库将非常有用。在长时间的梯度中，％B的起始值一旦明确，那么在缩短时间时，就把％B的值降10%。举例来说，如果％B初始值是40%，那么在运行液质药动方法时，起始值%B就是30%。这种方法将确保你的化合物可以留在你的柱子上。

优化柱子和流动相：

在上面举例的液相条件中，一些化合物有可能响应得不好。一些化合物可能要求不同的有机改性试剂或有机相。一般，磷酸盐不适用于质谱。有些人用10～20mM低浓度的醋酸铵作A相缓冲盐。另一些人合并甲醇和乙睛在B相中。如果你的化合物峰形不好，需要改变几个或者所有的实验参数。必须选用合适的柱子去获得好的回收和好的峰形。
帮助提示：

1）一个质谱实验室可能要整日忙着做色谱方法开发，尤其是如果这个实验室每周要接5～10个新化合物样品。在组合化合物和它们的内标，进行组合的色谱方法开发方面我们颇有心得。并不是所有的化合物适用于这种方式，但是这个方法为我们节省了大量的方法开发的时间。当我们发现做6个化合物混合样的方法开发时间，和一个化合物的几乎一样时，这个在新的组合给药（cassette dosing）方法开发中，该方法就变得非常有用。
注：cassette dosing 是一种新的给药方法，称为盒式给药法，又称为组合给药技术，由Ber- man等提出，即给动物同时服用几种药物，按常规取样时间取血，运用 HPLC联用技术进行样品处理分析。

2）加速方法开发。许多常见化合物如布洛芬已经有人建立了方法，检索一下文献、互联网和USP的出版物，查到这些方法。不要浪费时间从头开始!

3）组合给药技术常常加速化合物筛选过程。许多研究者不愿做组合实验技术，是因为害怕药物-药物相互作用。一种可取的方式是给药后合并化合物。合并上述的方法开发方法，可以为任务重的实验室节省大量的时间。

4) HPLC自动进样器往往是出奇的慢，记得在平衡时间里考虑自动进样器，因为当自动进样器工作时，柱子是在初始化（initial）条件下被清洗的，必须在平衡时间里考虑这个时间。你可以从方法里砍掉30～60秒的平衡时间。要分秒必争嘛！从300个样品分析中，每个砍掉30～60秒，就是5个小时啊！


解读ESI电喷雾质谱
第七页
电喷雾谱图读谱秘诀及其FAQ
读谱秘诀

在谱图里我寻找什么峰？

 
1) 寻找谱图中在200 u以上的最高的峰。因为低质量端往往混淆了大量的溶剂噪音。然后寻找那些大约在质量2倍或一半的峰。这样可以迅速地告诉你是否存在多电荷，可以帮助你确定分子量。

2)  计数信号强度 要知道谱图中强度为1.0×106 是可靠的，而1.0×104不可靠

3) 谱图质量非常重要。若解析低质量的谱图，你会浪费大量宝贵的时间。如果你对谱图质量不满意，试着平均几张或更多的低质量的谱图（averaging），去获得一个更高质量的“平均后的质谱图”。把这张平均后的质谱图和背景比较，看看是否突出了样品峰。

4) 重现性很重要。谱峰必须是一致的才能被考虑为相关的峰。你不应该使人相信所谓的“一次性扫描奇观”

5) 当仅有一个明显的峰（即无多电荷高斯分布）时来确定电荷态。
一个分子除了加H＋，还会加合其它的离子。寻找加Na＋或加NH4＋的峰。这些加合离子常给你峰的电荷态的线索。例如，如果在谱图中仅有一个主离子，寻找随之出现的加Na＋峰。如果带单电荷，那么M＋Na＋峰比M＋H＋峰多22 u；如果是双电荷，则多11 u
同位素
如果你使用的质谱有足够的分辨率，那么看看同位素峰，单电荷离子的同位素峰之间差1 u；双电荷离子的同位素峰之间差0.5 u；三电荷差0.33 u等等。这是另一种推断电荷态和分子量的方式。


Frequently Asked Questions常见问题和解答


问：我如何知道一个峰是真实的？
答：哇，这是一个问题。所有的峰都是真实的。在一个LC/MS实验中，我们寻找那些在多个相邻的扫描（但不是每个扫描）中重现的峰，如果每次扫描该峰都出现，它可能是背景峰。它可能是仅发生在一次或零星扫描中的系统的噪音或毛刺，很可能是电学或其它形式的系统噪音。

问：我如何确信鉴定了一个峰？
答：哦，质量只是质量，许多化合物有同样的质量，因此你不能仅从质量来确认一个化合物。在过去，我们可以酶解一个蛋白，进行一个LC/MS 肽质量指纹图谱实验，去匹配那些理论的肽质量碎片。今天，鉴定蛋白的规则更严格，我们进一步用MS/MS产生的CID谱，去匹配理论的肽的CID碎片。这样给我们一个阳性的鉴定结果（positive ID）。在LC/MS实验中另一个被忽略的因素是那个使LC/MS联用如此强大的原因之一，即质量和LC保留时间的关联。如果一个分子的特有保留时间以前被表征过，这条信息也能被和质量信息关联起来获得阳性的鉴定结果。

如果你正在表征一个新的分子，试着修饰这个分子，看看是否能改变其质量。
如果是未知蛋白，试着酶解它。如果这是一个小分子，试着化学修饰它，看看在质量鉴定中它是否产生你预测的质量变化。

问： 我如何区分某质量是化合物的分子量，还是质量的两倍（双聚体）？如：一个化合物分子量是1000，则会在m/z 1001和501出现峰；另一个化合物分子量是2000，会在m/z 2001、1001、666.7、和501出峰。而若分

楼主呀，这要分定性还是定量吧。

定量时，如果要优化得更好，追求灵敏度嘛，注射泵优化做完后，还要再做六通阀优化。这个六通阀，是为了不接柱子时，用流动相模拟实际的流速做优化。

无论哪家的质谱，做标物和纯净样品用直接进样，复杂基质最好经柱分离后进样。