主题：【线上讲座19期】分光光度法测定乳与乳制品中硝酸盐和亚硝酸盐的含量及干扰消除方法（本期活动时间结束）

本楼为大家问题汇集帖：（不断添加中...）
1.硝酸盐与亚硝酸盐既然有害，那么普通百姓能不能用什么简单的方法来鉴别下呢？
2.我不明白乳制品中硝酸盐和亚硝酸盐的来源？
3.是否把原来的标准方法贴出来啊?个人为例，我不是做这个行业的，具体做法不知道。但是由于对现实生活有很大帮助，很想了解一下！
4.硝酸盐与亚硝酸盐对人体的危害有哪些呢？
5.添入添加剂的酸奶，经常会造成假阳性的发生，从样品前处理和仪器技术方面如何克服？
6.乳制品的亚硝酸盐含量可否用以下原理测定：样品经沉淀蛋白质，除脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合形成红色染料，通过测定吸光度可与标准进行比较定量？
7.硝酸盐和亚硝酸盐能互相转化么？现在知不知道互相转化的条件是什么？
8.1997年的标准中，亚硝酸盐的检出限为0.2mg/kg，而2008年却变成0.4mg/kg，例子色谱法是否优于分光光度法？
9.我在用镉柱还原法测定硝酸盐时，空白总很高，把镉粒用盐酸还原后用水洗，但空白还很高。请问该如何把空白降下来?
10.测硝酸盐时，加入5ml氨缓冲掖，液体变混浊，是何原因?
11.本方法对工作曲线方程的a、b、k值是否有要求呢？
12.我要测定粮食中的亚硝酸盐含量，如何做？
13.日常生活中食品中的硝酸盐和亚硝酸盐的主要来源有哪些？如何甄别？
14.既然乳制品如酸奶若储存不当也会使其中的亚硝酸钠含量增加，我想知道哪些不当的储存会引起亚硝酸钠含量增加?我们该采取哪些措施去避免呢？
15.硝酸盐和亚硝酸盐的比例是多少才不至于危害身体健康，不是说亚硝酸盐是有毒的吗？
16.我们主要做卤制品中亚硝酸盐检测，往往都是集中一个、两个晚上采样送到实验室检测，一百多个样品，用国标GB/T5009.33中的重氮法很费事，用快检试剂测定好像又不是很精确，不知有没有什么办法平衡？
17.如果我想检测一个样品含量在99%以上该如何处理呢，标准溶液的浓度怎么配制？
18.食品安全越来越受到大家的重视，硝酸盐和亚硝酸盐人体中也有，国际上或国内是否有人体中含量方面的数据，比如，血液中、肠道中。这可能对控制摄入量是很重要的。以上网友提到一些含量较高的食品，如腌制肉类，咸菜，好像还有皮蛋，是不是腌制过的食品一般亚硝酸盐含量都比较高，能高至多少？
19.没有双光束功能的分光光度计是否就不能来分析酸奶中(颗粒和色素干扰)亚硝酸盐了？如果直接在538nm 处检测滤液的吸光度，并从加3种成色剂后的吸光度中减去那个背景吸光度，用单光束的设备就可以了，因为你的背景校正也是用滤液的。
20.我在亚硝酸盐做的过程中 偏差比较大 不知道为什么? 而且样品出来的结果一般是负的一般都在-0.005左右 我做的是乳粉能解释一下吗？ 是我的仪器有问题？ 还是水和试剂有问题还是 ？空白值一般在0.100左右.
21.为何烧熟的蔬菜放置过夜会产生亚硝酸盐？

一、果酱中亚硝酸盐的测定：

亚硝酸盐广泛存在于自然界，在果酱中也有一定的含量。现已证明，亚硝酸盐与食品中固有的胺类化合物是产生致癌物质-亚硝胺的前体物质。因此，对果酱中亚硝酸盐含量的检测和控制是非常有必要的。
在果酱测定亚硝酸盐的过程中，用沉淀剂将样品处理后进行过滤，在滤液中加入磺胺和N-1-萘基-乙二胺二盐酸盐，使其显粉红色，然后用分光光度计在其最大吸收波长下测定其吸光度。将测得的吸光度与亚硝酸钠标准系列比较定量。
亚硝酸根与芳胺或苯甲胺反应生成致癌物亚硝胺已经引起国内外的普遍关注。随着分析化学新方法和新技术的不断出现和发展，食品中亚硝酸盐的检测方法也更加多样化，新的检测方法层出不穷。亚硝酸盐是潜在的致癌物质，而乳与乳制品中亚硝酸盐含量过高会引起高铁蛋白症，因而要严格控制其含量。
1 主要试剂和仪器
1.1仪器：UV-2550型紫外可见分光光度计（岛津有限公司）
1.2试剂：
标准亚硝酸盐溶液：GBW（E）0802230504水中亚硝酸盐-氮,浓度：100mg/mL,并逐级稀释为0.9857μg/mL的标准贮备液；
硫酸锌溶液：535g/L;亚铁氰化钾溶液：172g/L;
盐酸-氨水缓冲溶液：pH9.6~9.7；
显色液1：盐酸：水= 450：550（V：V）盐酸溶液；
显色液2：5g/L磺胺溶液；
显色液3：1g/L萘胺盐酸盐溶液。
试验中所用试剂均为分析纯，所用水为去离子水。
2 试验方法
2.1工作曲线
　  标准曲线的绘制：取 6个50mL容量瓶，分别加入浓度为0.9857μg/mL的亚硝酸钠标准贮备液0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0mL，加水至20mL，并做空白试验，然后依次加入3mL显色液1，2.5mL显色液2，混合均匀后，静置5min,加1mL显色液3, 静置5min，用去离子水定容至刻度,此溶液浓度分别为0.00、1.96、  9.86、19.72、59.14、98.56、197.14μg/L。静置5min后于540nm处，用１cm比色皿进行测定，并以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线(见图1)。工作曲线方程为A=0.0011C+0.0026，相关系数r2=0.9995。


图1 工作曲线
2.2样品测定
2.2.1 样品前处理
将样品用粉碎机粉碎后，称25~30g样品，按顺序加入25mL硫酸锌溶液，25mL亚铁氰化钾溶液，40mL盐酸-氨水缓冲溶液，每加一种试剂充分混合，用去离子水定容于250mL容量瓶中，静置40min,用定性中速滤纸过滤后收集滤液。
2.2.2样品测定
移取20mL滤液于50mL容量瓶中，加3mL显色液1，2.5mL 显色液2，摇匀，静置5min；加1mL显色液3，静置5min，定容后静置5min，上机。同时移取20mL滤液于50mL容量瓶中做为参比溶液，加水定容至刻度，摇匀后静置，与样品同测,测定结果见表1


3．结果讨论
3.1参比选择 选择适当的参比溶液，消除滤液中有色物质的干扰。 本试验以被测溶液作参比溶液，不仅能消除吸收池壁对光的反射和散射带来的干扰，还能消除滤液中共存离子对光的选择性吸收和滤液中有色物质所带来的干扰，所以采用不加显色剂的被测溶液作参比溶液。
3.2干扰消除 在样品前处理后，在滤液中的某些成分影响被测组分吸光度时，将构成干扰，影响测量结果的准确性。某些干扰离子与试剂生成有色配合物，使测定结果偏高；某些干扰离子与试剂反应，生成的配合物虽然无色，但消耗大量的显色剂，使被测离子的显色反应不完全，使测定结果偏低；某些干扰离子与被测离子结合成离解度小的另一种化合物，使被测离子与显色剂不反应，使测定结果偏低。
加入盐酸-氨水缓冲溶液，控制溶液的酸度，从而消除干扰。因为控制溶液酸度在一定范围，可以使亚硝酸盐与显色剂反应，干扰离子不能生成有色化合物。
3.3分析结果及回收率

4．结论
双光束分光光度法测定果酱中的亚硝酸盐，非常有效的消除了果酱中有色物质对测定的影响，灵敏度高，检出限低，选择性强，准确可靠，测定方法简便，快速。
5.果料酸奶的测定

果料酸奶中果料对测定结果的影响，尤其草莓等，采用双光束消除。
下表为果酱中亚硝酸盐和硝酸盐的数值：



乳清蛋白粉、酸奶一类，滤液浑浊的消除，从比尔定律角度分析。

5.1果料酸奶
  此类情况最显著的表现是滤液有颜色，草莓类果料酸奶情况尤为严重，在用硫酸锌和亚铁氰化钾沉淀过程中，果料中的色素没有被沉淀完全而进入滤液，使滤液显一定的颜色，如果完全按照国家标准GB/T5009.33-2003或GB/T5413.32-1997中直接测定，则测定结果偏高，势必造成假阳性的情况。

当滤液澄清但有颜色时，其滤液中的有色物质在可见光区有吸收，在538nm处与亚硝酸盐吸收峰叠加，使吸光度偏高。为此，采用双光束分光光度法来消除滤液背景的干扰，从而真实反映出亚硝酸盐的响应值。

5.2 乳清蛋白粉类
  此类样品的表现是滤液无颜色，但稍微有浑浊。浑浊样品在上机过程中，偏离朗伯-比尔定律，使测定结果偏高。
样品浑浊，其中被测物质的分布不均匀，入射单色光就会因色散，反射而使透射光的强度减弱，检测器所得到的吸光度就会比实际的正确值偏大，导致偏离朗伯-比尔定律。



Griess法的测定极限是0.02~2“mol/L,最大检出限为1mg/kg，具有高灵敏性、高准确度和再现性好的特点，且简单有效，但在复杂介质中侧定会受到样品本身颜色影响格里斯试剂比色法的原理:样品经沉淀蛋白质、除脂肪后，在弱酸条件下N0z与对氨基苯磺酸(磺胺)重氮化反应后，再与N一卜蔡基乙二胺(即盐酸蔡乙二胺)偶合形成红色偶氮苯染料，其最大吸收波长为550nm，若所选择的反应物不同，最大吸收光谱也有所不同(一般为500-600nm)。目前使用最多的反应剂是磺胺和N-1-萘基乙二胺、在540nm处比色测定。


大家现在可以提问啦，也可以分享您是如何测试“乳与乳制品中硝酸盐和亚硝酸盐”的。您的测试方法是怎样的？

楼层征用：

二、乳与乳制品中亚硝酸盐的测定：

亚硝酸盐广泛存在于自然界，在乳与乳制品中都有一定的含量。现已证明，亚硝酸盐与食品中固有的胺类化合物是产生致癌物质-亚硝胺的前体物质，是潜在的致癌物质，亚硝酸盐含量过高会引起高铁蛋白症。因此，对乳与乳制品亚硝酸盐含量的检测和控制是非常有必要的。
在乳与乳制品测定亚硝酸盐的过程中，将样品沉淀脂肪和蛋白质后，进行过滤。在滤液中加入磺胺和N-1-萘基-乙二胺二盐酸盐，使其显粉红色，然后用分光光度计在其最大吸收波长538nm下测定其吸光度。将测得的吸光度与亚硝酸钠标准系列溶液的吸光度进行比较定量。
1 主要试剂和仪器
1.1仪器：UV-2550型紫外可见分光光度计（岛津有限公司）
1.2试剂：
标准亚硝酸盐溶液：GBW（E）0802230504水中亚硝酸盐-氮,浓度：100mg/mL,并逐级稀释为0.9857μg/mL的标准贮备液；
硫酸锌溶液：535g/L;亚铁氰化钾溶液：172g/L;
盐酸-氨水缓冲溶液：pH9.6~9.7；
显色液1：盐酸：水= 450：550（V：V）盐酸溶液；
显色液2：5g/L磺胺溶液；
显色液3：1g/L萘胺盐酸盐溶液。
试验中所用试剂均为分析纯，所用水为去离子水。
2 试验方法
2.1入射光波长的选择
国标《GB/T5413.32-1997 乳粉 硝酸盐、亚硝酸盐的测定》中规定最大吸收波长为538nm，但在实验过程中，做光谱扫描时，最大吸收波长往往因为样品的不同而发生变化，发上红移或蓝移的现象。考虑到测定的灵敏度，应采用最大吸收波长作为入射光波长。所以，在进行定量分析之前，应先才用光谱扫描进行峰形和峰位的确认。
以表1的仪器条件，对亚硝酸盐标准系列进行扫描，光谱图如图1。图1中曲线均比较平滑，为了消除干扰组分的吸收，采用“吸收最大，干扰最小”的原则，即所选择的测定波长处待测组分的吸收最大，但干扰组分的吸收最小；从消除非单色光引起的对郎伯比尔定律的偏离角度考虑，应选用吸收曲线比较平坦部分对应波长的光作为入射光波长。
综上所述，应选择图1中538nm作为入射光波长，与国家标准一致。



图1 标准系列吸收光谱图 

             
2.2标准曲线
　  标准曲线的绘制：取 6个50mL容量瓶，分别加入浓度为0.9857μg/mL的亚硝酸钠标准贮备液0.0，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0mL，加水至20mL，然后依次加入3mL显色液1，2.5mL显色液2，混合均匀后，静置5min,加1mL显色液3, 静置5min，用去离子水定容至刻度,此溶液浓度分别为0.00、9.86、19.72、59.14、98.56、197.14μg/L。静置5min后于538nm处，用１cm比色皿进行测定，并以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线(见图2)



图2 亚硝酸盐标准曲线
    标准曲线方程为A=0.0011C-0.0005，相关系数r2=0.9999。
2.3样品测定
2.3.1 样品前处理
称90.0g左右牛乳样品，按顺序加入25mL硫酸锌溶液，25mL亚铁氰化钾溶液，40mL盐酸-氨水缓冲溶液，每加一种试剂充分混合，用去离子水定容于250mL容量瓶中，静置40min,用定性中速滤纸过滤后收集滤液。
2.4.2样品测定
移取20mL滤液于50mL容量瓶中，加3mL显色液1，2.5mL 显色液2，摇匀，静置5min；加1mL显色液3，静置5min，定容后静置5min，上机测定。
3结果与讨论
干扰消除一般有两种方法，一类是不分离的情况下消除干扰，另一类是分离杂质消除干扰。因为在分离过程中，会造成硝酸盐和亚硝酸的损失，所以一般在不分离的情况下消除干扰。本试验采用双光束分光光度法，在不分离的情况下消除干扰。
3.1在样品前处理后，在滤液中的某些成分影响被测组分吸光度时，将构成干扰，影响测量结果的准确性。干扰离子与试剂生成有色配合物，使测定结果偏高；干扰离子与试剂反应，生成的配合物虽然无色，但消耗大量的显色剂，使被测离子的显色反应不完全，使测定结果偏低；与被测离子结合成离解度小的另一种化合物，使被测离子与显色剂不反应，使测定结果偏低。
加入盐酸-氨水缓冲溶液，控制溶液的酸度，从而有效的消除了干扰。因为控制溶液酸度在一定范围，可以使亚硝酸盐与显色剂反应，干扰离子不能生成有色化合物。
3.2选择适当的参比溶液，消除显色剂本身颜色和某些共存的有色离子的干扰。干扰离子本身有颜色，使测定结果偏高；
    本试验选择溶剂参比和试液参比分别进行考察：溶剂参比：当显色剂及其他溶剂均无色，被测溶液中又无其他有色离子时，可用溶剂-去离子水做参比溶液。试液参比：显色剂无色，被测溶液中有其他有色离子，可采用不加显色剂的被测溶液做参比溶液。
    以去离子水作溶剂参比，只能消除吸收池壁对光的反射和散射所带来的干扰；以被测溶液作试液参比，不仅能消除吸收池壁对光的反射和散射带来的干扰，还能消除滤液中共存离子对光的选择性吸收所带来的干扰。所以采用不加显色剂的滤液作试液参比。
    3.3选择适当的波长消除干扰。
入射光波长的选择必须从灵敏度与选择性两方面来考虑，从吸收曲线的峰形来看，无杂峰干扰，应选择最大吸收波长进行测定，这样灵敏度高，偏离郎伯-比尔定律的程度较小。本实验通过光谱扫描，从吸收光谱图上测定最大吸收波长后进行定量分析，避免了波长偏差带来的误差和干扰。
3.4精密度试验
分别称取纯牛乳﹑原味酸牛乳﹑全脂乳粉和乳清蛋白粉样品，用上述方法进行测定，计算结果见表2：（单位：μg/L）




3.5加标回收率试验
在纯牛乳﹑原味酸牛乳﹑全脂乳粉和乳清蛋白粉样品中，分别吸取0.50，1.00，1.50，2.00mL 浓度10mg/mL的标准亚硝酸盐溶液进行加标回收试验，结果见表3。



4．结论
双光束分光光度法测定纯牛奶中的亚硝酸盐，灵敏度高，检出限低，选择性强，准确可靠，有效的消除了共存离子干扰，测定方法简便，快速。

为方便大家交流，把标准方法帖出来
GB/T 5413.32-1997 乳粉 硝酸盐、亚硝酸盐的测定 被代替 GB/T 5009.33-2008


GBT5009.33-2008.pdf

楼层征用：

三、酸牛乳中亚硝酸盐测定的背景干扰及消除方法

1 前言
亚硝酸盐是潜在的致癌物质，而乳与乳制品中亚硝酸盐含量过高会引起高铁蛋白症，因而要严格控制其含量[1]。酸牛乳中由于含有各式各样的食品添加剂，在测定亚硝酸盐过程中，用硫酸锌和亚铁氰化钾沉淀不完全，导致部分小分子物质进入滤液，使滤液浑浊，而这种浑浊一般是肉眼不可见的。在分光光度计上比色时，却能引起吸收，导致测定结果偏高，造成假阳性的情况。
  笔者针对此种情况，建立了以滤液为参比溶液，消除酸牛乳中细小颗粒对检测结果的影响，结果令人满意。
2试验部分
2.1仪器和试剂
2.1.1仪器：UV-2550型紫外可见分光光度计（岛津有限公司）
2.1.2试剂：
标准亚硝酸盐溶液：GBW（E）0802230504水中亚硝酸盐-氮,浓度：100mg•mL-1,并逐级稀释为0.9857μg•mL-1的标准贮备液；硫酸锌溶液：535g•L-1;亚铁氰化钾溶液：172g•L-1;盐酸-氨水缓冲溶液：pH9.6~9.7；显色液1：盐酸：水= 450：550（V：V）盐酸溶液；显色液2：5g•L-1磺胺溶液；显色液3：1g•L-1萘胺盐酸盐溶液。
试验中所用试剂均为分析纯，所用水为去离子水。
2.2标准溶液的配置
标准曲线的绘制：取 6个50mL容量瓶，分别加入浓度为0.9857μg•mL-1的亚硝酸钠标准贮备液0，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0mL，加水至20mL，并做空白试验，然后依次加入3mL显色液1，2.5mL显色液2，混合均匀后，静置5min,加1mL显色液3, 静置5min，用去离子水定容至刻度,此溶液浓度分别为0.00、 9.86、19.72、59.14、98.56、197.14μg• L-1。静置5min后于538nm处，用１cm比色皿进行测定。
2.3试验过程
2.3.1吸收光谱曲线的绘制
在光谱模式下，测定标准系列的光谱图，仪器条件见表1。



在此仪器条件下，扫描出标准系列的吸收光谱图，见图1。




图1 标准系列吸收光谱图
2.3.2标准曲线的绘制
在光度测定模式下，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，见图2。工作曲线方程为A= 0.0011C - 0.0005，相关系数r²=0.9999。






图2 亚硝酸盐标准曲线
2.2样品测定
2.2.1 样品前处理
将酸牛乳样品混合均匀后，称70g左右样品，按顺序加入35mL硫酸锌溶液，35mL亚铁氰化钾溶液，50mL盐酸-氨水缓冲溶液，每加一种试剂充分混合，用去离子水定容于250mL容量瓶中，静置40min,用定性中速滤纸过滤后收集滤液。
2.2.2样品测定
移取20mL滤液于50mL容量瓶中，加3mL显色液1，2.5mL 显色液2，摇匀，静置5min；加1mL显色液3，静置5min，定容后静置5min，上机。同时移取20mL滤液于50mL容量瓶中做为参比溶液，加水定容至刻度，摇匀后静置，与样品同测,测定结果见表1




3结果与讨论
3.1牛乳与酸牛乳光谱图比较
  国家标准GB2746-1999[2]中规定酸牛乳中亚硝酸盐的限量为≤0.2mg•kg-1，而按照国加标准规定的方法检测，则均判定为阳性样品，而在扣除背景干扰后，样品检测结果均合格。
国家标准检测方法在检测牛乳类样品时，几乎不存在干扰情况。图3（图中虚线为标样吸收光谱图，实线为样品吸收光谱图，下同）为牛乳样品光谱图与标样吸收光谱图比较，从图中可以看出，牛乳样品的亚硝酸盐样品光谱图和标样光谱图基本一致，确认其为亚硝酸盐，然后测定其峰高及吸光度值进行定量计算。




图3 牛乳样品光谱图
酸牛乳加入各种辅料，比如食品添加剂，增稠剂，甜味剂等，经过发酵以后，成分相对比牛乳复杂的多，在经过沉淀剂沉淀以后，滤液中含有沉淀不完全或粒径较小的颗粒。而这些颗粒在测定波长538nm处有吸收，从而干扰目标组分的测定。
图4为酸牛乳样品光谱图，从图中可以看出，由于干扰的存在，各个吸收峰叠加，分辨不出亚硝酸的吸收峰。按照国标方法，直接测定吸光度定量，则造成假阳性的情况。






图4 酸牛乳样品光谱图

3.2背景干扰及消除方法
笔者经过大量的试验研究，认为背景干扰主要来自滤液中杂质组分和颗粒在538nm存在吸收，干扰导致酸牛乳样品吸收光谱变形，其背景干扰光谱图如图5所示。滤液中有杂质组分和小分子物质，入射单色光就会因色散﹑反射而使透射光的强度减弱，检测器所得到的吸光度就会比实际的正确值偏大[3]；量子光学认为，吸光粒子间的平均距离减小，受粒子间电荷分布相互作用的影响，其摩尔吸收系数发生变化[4]。以上两种情况导致偏离比尔定律。而这种干扰往往是肉眼不可见的，常常在检测中被忽略。






图5 背景干扰光谱图
本试验采用20mL滤液为参比进行背景扣除，以此来消除干扰[5]。从图5中可以看出，背景干扰在538nm处产生一定的响应。而这种响应导致偏离比尔定律，使测定结果偏高。
    扣除背景干扰后，其光谱图见图6。从图6中可以看出，消除背景干扰后的光谱图和标样光谱图基本吻合，说明干扰已经消除，此时再进行吸光度测定，就能真实反应样品中亚硝酸盐的含量。




图6消除干扰后吸收光谱图

4 结论
    通过以上试验可以说明，背景对酸牛乳中亚硝酸的测定干扰很大，容易造成假阳性。而通过滤液参比进行背景的扣除，基本消除了背景干扰对测定结果的影响。该方法操作简单，消除干扰效果好，适用于日常酸牛乳中亚硝酸盐的测定。

原文由 老多(emoc98311) 发表:
我不明白乳制品中硝酸盐和亚硝酸盐的来源？

应该是从水中引入的吧？

zhouyuhu版主：
您好！
是否把原来的标准方法贴出来啊?
个人为例，我不是做这个行业的，具体做法不知道。
但是由于对现实生活有很大帮助，很想了解一下！

原文由 老多(emoc98311) 发表:
我不明白乳制品中硝酸盐和亚硝酸盐的来源？

硝酸盐在很多添加剂中就有，对人体没有危害，而亚硝酸盐是由硝酸盐在一些特殊的环境中如长期的厌氧环境，产生的。

原文由 老多(emoc98311) 发表:
我不明白乳制品中硝酸盐和亚硝酸盐的来源？

常用的防腐剂亚硝酸钠便是来源之一。

乳制品中亚硝酸盐很少，硝酸盐挺多的！