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主题：【第三届原创参赛】黄酮类化合物的分离体会

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幽灵龙猫
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发表于：2010/09/19 13:16:43 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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维权声明：本文为xiaodu2007693原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

黄酮类化合物的分离体会 

【黄酮类化合物简介】

      黄酮类化合物（flavonoids）是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮（flavone）结构的化合物。它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态（苷元）的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方起着重要的作用。

【本人研究内容】

      我做的是某中药的化学成分研究，该中药中主要为黄酮类成分，遵循传统用药原则，我采取水煎煮，之后水提液浓缩至一定体积，过大孔吸附树脂，乙醇水梯度洗脱，梯度：水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇。每个梯度做为一个流分，再进行细分。下一步主要是运用聚酰胺柱色谱，中低压ODS，Sephadex LH20进一步分离，最后制备液相得到单体化合物。

【经验分享】

      主要和大家分享我使用聚酰胺柱的经验，我一般是聚酰胺薄膜结合聚酰胺柱，类似于硅胶板结合硅胶柱。所用的聚酰胺为30-60目，聚酰胺薄膜一盒50片，规格为8cm x 8cm，70块钱左右，可以根据需要剪成条状使用。聚酰胺薄膜常用的溶剂系统说明书上有，我常用甲醇-水，因为黄酮类化合物有一定的酸性，展开剂要加点酸，甲酸乙酸都可以，抑制其解离，保持游离状态的话，样品成点性好，否则拖尾很严重。在此需要指出的是，聚酰胺可以用反相溶剂系统，如甲醇水；也可以用正相溶剂系统，如二氯甲烷甲醇。要根据自己样品的极性来定。以我的80%乙醇洗脱物为例，进行详细的叙述。此部分极性较小。我用二氯甲烷溶解，拌样，挥干。洗脱系统为甲醇水，聚酰胺柱起始用水装柱，上样，上面要放一块棉花，然后用玻璃塞子压住（聚酰胺比较轻，防止加溶剂时冲起来），甲醇水梯度洗脱。之前点板显示，50%甲醇水刚刚展开一点，因此起始用50%甲醇水洗脱，然后梯度设为55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、最后甲醇冲柱。过程中每100mL一接，蒸干转移至小瓶。最后用一大块聚酰胺对得到的流分进行合并。得到大概9-10个流分，HPLC-DAD分析，找到合适的液相色谱条件之后，用制备液相进行制备。
【部分聚酰胺薄层谱图展示】

左图：展开剂：（甲醇：水90：10）+2滴乙酸；
右图：展开剂：（甲醇：水80：10）+2滴乙酸，最右边的点为总样
显色剂为：三氯化铁乙醇溶液

【体会和教训】
      黄酮类化合物用聚酰胺分离效果非常好，但是死吸附较严重，样品比较多时可以使用，少就算了。凝胶Sephadex LH20效果也非常好，建议多使用。黄酮类成分溶解性比较折磨人，但提醒一点在进行制备液相时，样品一定要用流动相溶解，或接近流动相，多加点总会溶解的，然后用0.45μm滤膜过滤。不用流动相溶解很容易把柱子弄裂分。原因在于，进样之后，样品析出，堵了柱塞板，导致局部流速过快，冲塌固定相。我就把老师的预柱整裂分了，多亏了预柱啊，保护了柱子，要不然老师肯定疯了，但是后来寄出去修预柱，别人检测又很神奇地自动好了，这有点解释不了，呵呵，这事也不是常能碰到的，最好按规矩来，否则耽误别人实验不太好。先就写这么多，实验也不是那么成功，但拿出来和大家交流，不对的地方请批评指正。
【样品导致预柱裂分的后果-色谱图展示】
 
左图为：样品制备时色谱图，当时已裂分
右图为：预柱用纯品检测色谱图，连续进样2针，可见预柱裂分严重。
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kaikaifeng
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2010/9/19 13:19:45 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
很好很强大~
关于制备液相的时候，黄酮类用流动相溶解，我也有相同体会~
若不小心，容易造成液相压力升高，很烦人的~
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阿宝
lpr20
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2010/9/19 13:25:04 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主加上个对比的图谱效果会更好
更直观
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kaikaifeng
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2010/9/19 13:31:57 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼上的是说制备液相的裂分图吗？
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幽灵龙猫
xiaodu2007693
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2010/9/20 11:29:56 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 阿宝(lpr20) 发表:
楼主加上个对比的图谱效果会更好
更直观


好的，我还要进行编辑，到时候上传图。
该帖子作者被版主 kaikaifeng加 4积分， 2经验，加分理由：谱图完善加分~
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2010/9/20 12:13:23 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
好，等你把谱图传上来，再给予奖励~
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baixi2010
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2010/9/20 14:30:51 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
请问楼主，您用的大孔树脂和聚酰胺柱子是普通的色谱柱吧！如何达到控制流速的目的呢。我最近用130-200目的聚酰胺纯化黄酮，柱子的流速很慢
该帖子作者被版主 kaikaifeng加 2积分， 2经验，加分理由：欢迎常来~
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liuliuhui
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2010/9/20 20:29:52 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
总结得很详细，凝胶确实挺好用，楼主有可能的话一定要尝试一下
该帖子作者被版主 xiaodu2007693加 1积分， 2经验，加分理由：谢谢
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elvisnoxug
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2010/9/21 11:27:49 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
好帖，期待继续，继续，继续！
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elvisnoxug
xuxushug
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2010/9/21 12:04:43 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
最后用一大块聚酰胺对得到的流分进行合并。得到大概9-10个流分，HPLC-DAD分析，找到合适的液相色谱条件之后，用制备液相进行制备。

这个还不是很清楚。合并的是什么？
后面制备液相是聚酰胺的柱子吗？如果是，压力是多少？
如果不是，条件是统一的吗？

非常感谢！
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kaikaifeng
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2010/9/21 15:55:56 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 xuxushug(xuxushug) 发表:
最后用一大块聚酰胺对得到的流分进行合并。得到大概9-10个流分，HPLC-DAD分析，找到合适的液相色谱条件之后，用制备液相进行制备。

这个还不是很清楚。合并的是什么？
后面制备液相是聚酰胺的柱子吗？如果是，压力是多少？
如果不是，条件是统一的吗？

非常感谢！


合并的应该是聚酰胺柱的各流分吧~
后面制备液相是根据HPLC-DAD分析结果来决定的~
HPLC-DAD分析、还有制备，都是C18柱子吧~
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