主题：【第三届原创参赛】环烯醚萜类化合物分离纯化心得体会

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环烯醚萜类化合物分离纯化心得体会

基本介绍
    环烯醚萜（iridoids）为臭蚁二醛（iridodial）的缩醛衍生物。臭蚁二醛是由伊蚊（Iridomyrmex detectus）的防收性分泌物中分得的物质。自1958年的Halpem和Schmid确定的环烯醚萜的基本骨架以来，各国学者对该类化合物作了大量深入的研究。环烯醚萜类化合物具有多种生物活性，近来受到极大关注，发展也很迅速。
    环烯醚萜类主要分为：环烯醚萜类、裂环环烯醚萜类、3,4-位无取代的环烯醚萜类、聚合环烯醚萜类等等。本人做的是普通类的环烯醚萜类化合物，且以其苷居多，做的比较浅，下面斗胆一谈，各位看官莫要见笑。

提取部分
    环烯醚萜苷类化合物在醇（甲醇、乙醇）中溶解度较好，部分苷类在水中溶解度也很好。本人在对某植物进行提取的时候，实际上并非针对这类化合物，采用的是60%的乙醇/水，是为了兼顾各类成分。后来在实验过程中发现，60%的乙醇/水条件下，这类化合物的提取率是很高的。
  注释：其实如果要针对性分离，可以将提取液简单处理后进行D101大孔柱色谱，对环烯醚萜类化合物进行富集。

萃取部分
    提取之后，将药液进行浓缩，至无醇味混悬于水中，然后进行萃取。萃取的过程为：等体积的环己烷、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取三次，合并各层提取液浓缩得各层浸膏。就目前实验进展情况来看，环烯醚萜苷类化合物主要集中在正丁醇层，水层也有一部分（我目前还没开始这部分工作）。
    注释1：萃取的过程，涉及到溶剂的回收，由于这类化合物在高温下不太稳定，所以用旋转蒸发仪进行减压回收溶剂的时候，温度不能过高，我采用的温度是60度（其实60度已经很高了，但是没办法，不设60度，正丁醇回收不了）。
   
硅胶柱色谱
    正丁醇层进行硅胶柱色谱分离，采用氯仿/甲醇梯度洗脱，样品500g，拌样硅胶1500g，柱床硅胶500g，洗脱梯度为50：1→20：1→10：1→5：1→2：1→1：1→0：1。实验的过程中发现，环烯醚萜类化合物，主要集中在氯仿：甲醇＝10：1和5：1部分。
    注释1：选择硅胶柱色谱，也是人之常情，此处也可选择D101大孔柱色谱，对这类化合物进行富集；
  注释2：选择氯仿/甲醇系统，是因为经过小试，此系统对样品分离较好，最重要的，样品在此系统中成点性很好；
  注释3：拌样1500g，柱床500g，你没有看错，我没有写错。书上说，拌样：柱床在1：1-1：10甚至1：20或者1：50，而我这里却是3：1。我可以很负责任地告诉你，没有必要按书上的说法，柱床500g足够了，分离效果一点也不差。以前做另外一个植物，拌样用了3000g，柱床才600g，分离效果也不差，一点问题都没有；
    注释4：梯度的选择，建议6-8个。梯度太少，各流分成分可能过于复杂；梯度太多，后续分离麻烦。这种大型硅胶柱色谱，属于平常所说的“粗分”，不宜太多，不宜太少，不然就是给自己找麻烦。


ODS柱色谱
    包括开放型ODS柱色谱和中低压型ODS柱色谱，其实原理一样，只是规模大小不同而已。
    我将5：1洗脱的样品进行中低压ODS柱色谱，采用甲醇/水梯度洗脱，水→10%甲醇/水→20%甲醇/水→30%甲醇/水→50%甲醇/水→甲醇，实验结果表明，ODS柱色谱对此类化合物具有良好的分离效果。
    注释1：环烯醚萜苷类化合物一般极性较大，一般集中在10%甲醇/水、20%甲醇/水、30%甲醇/水部分；
    注释2：水洗下来的，一般为糖苷类化合物，我从此流分中分离得到几个糖类化合物（题外话）；
    注释3：ODS柱色谱可以多次进行，反复纯化，利用ODS柱色谱可以得到部分单体化合物；

（注：此图为未合并相同流分前的点板情况）

制备液相（反相）
    从ODS柱色谱上洗脱的样品，经过分析，可以考虑进行制备液相，半制备液相等等。
    事实上，一般而言，PHPLC也是获得环烯醚萜类单体化合物最重要的手段之一。
    流动相可采用甲醇/水，若峰形不好，可加入少量乙酸改善（这一招屡试不爽）。
    波长的选择，可以使用230nm、240nm都可以（我们有PAD检测器，验证过）。其它一些化合物，由于连上芥子酰基，对羟基香豆酰基，还可以选择320nm的吸收。
    色谱柱一般是C18的居多（目前未使用过其它柱子），品牌好像都还行（我们主要使用YMC）。

凝胶其它填料
    由于分离原理的缘故，使用凝胶对环烯醚萜这一类化合物（分子量相差不大，且结构极为类似）进行分离，前景似乎并不明朗。但是，用凝胶将这一类化合物与其他类型的化合物分离，效果还是很不错的。 其它如大孔树脂，前面提过，用来富集是个不错的选择；聚酰胺，我没有使用过，不过从其分离原理来看，对这类化合物不会很敏感。

显色剂的选择
    部分环烯醚萜类在254nm紫外下有暗斑，这个很实用；
    最常用的是浓硫酸-香草醛显色剂：母核上有羟基取代的显蓝色；母核上无羟基取代显紫红色（非绝对）；
    其它显色剂如硫酸乙醇、碘等等都可以，我个人偏爱浓-香显色剂。

结构测定与解析（简）
    环烯醚萜类化合物进行NMR测试，首先氘代甲醇，这个没有任何疑问。
    我在一些文献中，也看到一些特例，比如使用重水、氘代DMSO，这些基本可以忽略。
    关于结构解析部分，此处不再赘述。