前言
药物代谢(drug metabolism)是研究药物在生物体内的吸收、分布、生物转化和排泄等过程的特点和规律的一门科学,即药物分子被机体吸收后,在机体作用下发生的化学结构转化。也是药物研发产业链中的重要环节,贯穿药物研究过程的始终。排泄是药物代谢研究过程中的一个重要环节,本实验涉及的是某黄酮成分在大鼠体内排泄的研究。
1.Chemical and reagents
甲醇(色谱纯,天津大茂),水(哇哈哈纯净水,杭州),三氟乙酸(TFA, Dikma, USA),其它试剂均为分析纯。
2.animals
Wista大鼠(220-250g,SPF级,由本校动物实验中心提供)
3.HPLC analysis of two important metabolites
Waters 高效
液相色谱系统,由Waters Model 600 controller
液相色谱,Millennium 32 工作站,Model Delta 600 泵,以及Waters 996 DAD检测器组成。
色谱柱:Ultimate XB-C18柱(5μm, 4.6x250mm)
流动相:A通道:甲醇,B通道:水(0.05%TFA) 梯度洗脱,具体流程未透露
流 速:1mL/min
柱 温:30℃
检测波长:190-400nm扫描
进样量:20μL
3.Sample preparation
大鼠灌胃给予该成分,剂量为30mg/200g,15min后用20%的乌拉坦溶液腹腔注射麻醉,行胆汁插管手术,缝合伤口,用规格为15mL的离心管收集12h内的胆汁,收集的胆汁过ODS,水洗脱,之后用甲醇洗脱,甲醇洗脱部分定溶到某体积,取一定体积过0.45μm微孔滤膜,HPLC分析,相同条件下与尿液中的代谢产物进行对照,确定该成分经大鼠灌胃后胆汁中排泄的代谢产物。
4.Results and discussion
Fig. 1. The HPLC chromatogram of blank bile.
Fig. 2. The HPLC chromatogram of bile sample(12h).
Fig. 3. The HPLC chromatogram of urine sample.
讨论1. 首先要说明的是此部分实验是之前实验的续集,所以之前的实验请参考我以前发的体验贴,图3给出的是尿液中代谢产物的色谱图,从图中我们可以很明确地看到8个代谢产物的色谱峰,这8个色谱峰已经通过各种柱色谱手段分离得到,且结构已经用1D NMR和2D NMR以及MS等谱学手段进行了鉴定。
讨论2. 图1和图2 分别为胆汁空白和样品色谱图,从该结果可知,有5种主要的代谢产物(M1 M2 M5 M6和M7)以及少量的M8经胆汁排泄,主要是通过保留时间,和紫外吸收进行了指认。
讨论3. 此外我们还发现,尿液中大量存在的代谢产物M3不经胆汁排泄。
讨论4. 通过对该成分在大鼠尿液中的代谢和胆汁排泄研究,我们可以得出这样的结果,尿液的内源性成分多为极性较大成分,多集中在保留时间靠前的范围,而胆汁中的内源性物质极性较小,如图2中50min左右的成分。
讨论5.该实验尚未发表,因此代谢产物的结构不便透露,待发表之后,具体的结果会和广大息友进行交流。
讨论6.最后也是最重要的,Ultimate XB C18柱对该类代谢产物表现了良好的保留能力和分离性能,代谢产物因为其结构中会结合亲水基团,如硫酸基,葡萄糖醛酸基等使其极性增加,易于从体内排出,因此这些成分往往表现了比较差的色谱行为,如强酸性导致的拖尾现象,因此需要在流动相中加入酸或者其它试剂进行调节,本实验流动相均为甲醇:水(含0.05%TFA),在此条件下,这些代谢产物在Ultimate XB C18柱上表现了良好的色谱行为。