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主题：【分享】武汉大学分子遗传学第四章

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发表于：2012/01/06 17:36:30 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

第四章 DNA复制、转录与翻译

4.1 DNA复制

一. DNA的半保留复制

Watson &Crick 最早提出DNA 的半保留复制机制。即是：DNA分子的双螺旋在复制时分开，各自作为新链合成时的模板，复制后，每一个新的双链DNA 分子都是由一条亲链和一条新合成的子链组成的。合成过程中亲链和子链间严格的碱基配对是DNA复制的基础。

图示DNA复制（Meselson-Stahl实验——Cscl超离心显示不同比重DNA带）

二. 复制原点，方向和方式或DNA复制是从特定的位点开始并按特定的方向进行

实验证明，DNA分子复制时不是随机起始的，而是从特定的位点开始的，这一特定的位点叫做复制起始点或复制原点，常用ori 或o 表示。

许多生物的复制点都是DNA呼吸作用强烈的区段，即是经常开放的区段（frequently opening region ）亦即富含A，T的区段。这一区段产生瞬时单链与SSB蛋白（single-stranded DNA binding protein）结合，对复制的起始十分重要。复制从特定的位置开始，大多数双向进行，也有一些单向的或以不对称的双向方式进行。

在复制原点双链DNA解旋形成复制叉。在复制叉处，新合成的子链DNA以各自的亲链为模板，总是从5\'-3\'方向合成。复制叉是不对称的，即两条新合成的链中，一条链是连续合成，叫前导链（leading strand ），另一条链是在模板DNA指导下，通过一个叫DNA 引发酶的蛋白质，在特定的间隔区先合成大约10个NT 的RNA引物为DNA聚合酶提供3‘——OH，然后合成一个称之为冈崎片段的不连续的DNA片段，再经专门的DNA修复系统，去除RNA引物，再经DNA连接酶通过磷酸二酯键将其连起来，完成该子链的合成，这一条链叫后随链（lagging strand）

。依据DNA合成的起始方式，复制分为两种类型：复制叉式（包括复制）和滚环式复制又叫复制。

三. DNA复制的酶学

是一个复杂的酶学过程，需要30多种酶而后蛋白质的参与，构成复制体（replisome）

1. DNA聚合酶及其聚合反应

DNA POL是指以脱氧核苷三磷酸为底物催化合成DNA的一类酶，其催化反应为：

DNApol.DNA-OH——————》DNA-（pdN）n +n ppidNTP Mg 2+

这一原理被应用于现代技术中如PCR中的Tag酶作用机理。

所有真核生物和原核生物都有几种DNA聚合酶，这些聚合酶协同作用负责染色体DNA的复制，DNA分子的修复，核DNA的重组以及染色体外DNA的复制。

原核生物有三种DNA聚合酶，即 Pol I， Pol II，Pol III，Pol III是DNA复制的主酶。

真核生物有五种DNA聚合酶，即，，，，。，，是复制主酶，是核DNA复制的重要酶。

2. 脱氧核苷三磷酸前体的来源

有两个来源：废物利用——体内核酸降解或直接来自培养基

新合成途径——利用生物体的氨基酸，CO2，NH3和磷酸核糖焦磷酸合成核

糖核苷单磷酸（NMP）

核苷单磷酸激酶

NMP + ATP ——————————NDP + ADP

核糖核苷酸还原酶

NDP ——————————dNDP

脱掉核糖2‘上的氧

核苷二磷酸激酶

dNDP + ATP ——————————dNTP +ADP （dNTP：四种脱氧核糖核苷酸）

所有生物的核酸链的合成都是按5‘——》3‘方向进行的，无一例外。

3. 三种DNA聚合酶的结构和功能

4. DNA连接酶

DNA Pol 虽能填充缺口，但不能使缺口接合，而连接酶则能完成接合任务。

5. 与DNA几何性质有关的酶

螺旋酶（helicases）又称解旋酶，使双链DNA 分离:

C. 螺旋酶I，II，与产物单链DNA结合

F. 螺旋酶III，催化双链DNA 分离，与SSDNA结合蛋白质配合。

DNA旋转酶（Eco拓扑异构酶II）

多数天然DNA具有负超螺旋，可变为泡状单链形式，利于蛋白质结合，并可缓解复制叉前移造成的抄缠现象，但当5%的环行DNA双链已经复制时，原有的负超螺旋已被用尽，若复制叉再前移，就产生拓扑学问题，就需要拓扑异构酶来解决。在Ecoli中，主要是DNA旋转酶（Eco拓扑异构酶II），他能产生负超螺旋并消除复制叉前移产生的正超螺旋。

所以，如果加入几种DNA螺旋酶的抑制剂，如香豆霉素，新生霉素，萘啶酮酸等均能抑制细菌DNA的复制， P94 图示复制叉前移的拓扑学问题。

DNA复制的半不连续性

1. 半不连续性复制的发现

2. 引物和引发酶

DNA复制过程中，复制叉是不对称的。两条新合成的链中，一条是连续合成的，叫前导链

；另一条是在模板DNA指导下，通过一种叫DNA引发酶的蛋白质，在特定的间隔区先合成大约10个核苷酸组成的RNA引物（RNA primer）为DNA聚合酶提供3’-OH，然后合成称为冈崎片段的不连续的DNA片段，最后由DNA修复系统去除RNA引物而代之以DNA，再由DNA连接酶通过3‘5’-磷酸二酯键将其连接起来，完成此子链的合成，这条子链叫后随链。

由于DNA聚合酶在没有引物情况下不能从头合成DNA，必须有一条引物。研究发现的引物大多数为一段RNA，长度和序列随基因组的种类而异，为1-10个核苷酸见表3 P98。

该引物RNA与经典的RNA（mRNA）不同，，他们合成后不与模板分离，而是以氢键与模板结合。他可能由一种独特的RNA聚合酶所合成，这种合成RNA引物的酶旧叫引发酶。那么，前导链是如何合成的？三种可能性：1）同后随链一样，由RNA引物提供3‘-OH；

2）可能模板上的起始点产生缺口，暴露3’-OH作引物；3）可能由后随链提供3‘-OH。

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2012/1/6 17:36:49 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

3. 前体片段的连接

真核生物的DNA复制

1 真核生物的复制原点，复制元和复制元族

真核生物的DNA聚合酶活性比大肠杆菌低得多，复制速度为500bp-5000bp/分（Ecoli为105bp/分）如按哺乳动物的DNA比细菌大约50倍，真核生物DNA复制时间就会是大肠杆菌的1000倍，即约一个月，而事实上，真核生物DNA复制时间一般为几小时，这是因为通过从许多原点同时开始并双向复制而实现的。放射形自显影可见许多的复制泡。每一复制泡有固定的一点（复制原点），然后双向伸展，与相酃的复制泡会合。这样一段DNA 称为复制单元，简称复制元（replicon）。而几个复制元可组成复制元族，同一族内的复制元基本同步。

真核生物复制原点的DNA序列并无固定的模式，但大多包含一个富含AT的序列，可能还有一个特异性蛋白质的结合位点。

2 真核生物的DNA pol 和引发酶primase

与真核生物多起点复制相适应的是，细胞中DNA聚合酶的分子数目多，在Ecoli中，POLIII只有10-20个分子，而哺乳动物细胞中DNA POL 有2000-60000个分子，DNA POL 与DNA引发酶结合很紧，是复制体系必需的复合物。

实验表明，在细胞DNA合成期（S期），DNA POL 含量剧增。协同的作用，负责线立体DNA的复制，含量变化不大，与损伤DNA修复有关。

引发酶的作用：

B. 是与引发酶复合物所必需的

E. 其引物合成方式特别，阵发性合成，

F. 可利用rNTP和dNTP为合成前体。

引物一般为6-15个NT。

1 SV40以及其他真核生物的DNA复制过程

SV40所编码的蛋白质中，只有一个大T抗原参与其DNA复制，其余复制机制由寄主的蛋白质构成。大T抗原四聚体在复制原点有三个结合位点，同时还具有ATPase活性和螺旋酶活性。

SV40的DNA复制有可能代表真核生物的DNA复制的主要过程：首先由一特异的蛋白质识别复制原点并与之结合。——》再由螺旋酶促进负超螺旋状的复制原点解链——》单链DNA结合蛋白质（SSB）维持解链区并以动态左右前移——》在由POL 和引发酶与原点上的特异蛋白质相互作用，从而引发复制叉的先导链的合成；然后再印发另一先导链的合成——》随着复制叉的前进，需要拓扑异构酶解除复制叉前进造成的超缠现象。当相酃的两个复制元的相向的两个复制叉结合时就完成了这一段DNA的复制，可能并不存在固定的终止序列。而真核生物染色体末端DNA的复制却不那么简单。见后。

2 真核生物染色体末端DNA的复制

由于RNA引物的水解，两个子代分子中各有一个5‘端缺少一段核苷酸，而没有一个目前已知的DNA POL能填补。

腺病毒DNA的5‘末端共价连接一个55kD的蛋白质，即末端蛋白质（Terminal Protein TP）,而正在复制的腺病毒新生的DNA 5‘端为80kD的蛋白质，为末端蛋白质前体（pTP），这一引发方式避免了线性DNA在复制结束后的5’末端隐缩问题。真核生物同样面临线性DNA复制结束时产生的5‘末端隐缩问题。这个问题的解决取决于端粒的结构和能够识别和结合端粒的蛋白和酶。

四膜虫端粒中有一种端粒酶（）能将其端粒结构中单链尾巴5‘TTGGGG3’延长，延长的部分仍是5‘TTGGGG3’，这一富含G的序列总是突出12-16个NT。这种酶是一种核糖核蛋白，由RNA和蛋白质组成。有人证明该酶中的RNA是富含G序列的模板，对拷贝出富含G序列所必需的部分为5‘CAAAACCCCAAAA3’，此RNA可能还有其他作用，这单链尾巴可能弯转成为引物复制5‘末端，另一可能是某种端粒蛋白结合末端的单链重复序列，并作为蛋白质引物复制DNA地’末端。

复制的调控

DNA复制是受调控的，细胞分裂时间因营养条件变化很大（21-70分钟/Ecoli），而DNA复制时间为40分钟左右，可用成熟前起始加以解释细胞分裂时间为21分钟的DNA复制。

DNA复制调控，可能涉及许多专一性的蛋白因子（Ecoli Dna A,SV40 大T抗原等）和至少一类RNA分子（RNA2，RNA1）。细胞中蛋白质和DNA总量的比例也可能是一重要因素，因为氨基酸饥饿时会抑制蛋白质合成和DNA复制起始。

在此说明一下RNA2和RNA1：

大肠杆菌质粒Col E1的复制需要一种RNA引物，RNA POL从复制原点上游方向555bp处转录，这个转录物就是RNA2。 RNA2延伸至复制原点区域时，由RNAaseH 将RNA与DNA模板形成的杂合双链中的RNA切断，从而产生3’-OH末端，然后，DNA POL以此引物合成DNA。图示P130。

在ColE1复制原点上游方向445bp处（相当于RNA2的第111个碱基位置），起始转录另一个RNA分子，即是RNA1，其转录方向与RNA2相反。这个反义的RNA1有111个碱基与RNA2的5’末端互补，从而改变了RNA2的二级结构使之不能为RNAaseH（识别杂交双链但不识别二级结构）所识别，于是，RNA2的转录能够继续进行，而不能在复制原点区域RNA。有些机理有待继续探讨

4.2 转录

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4.2 转录

一概述

`

三类RNA都必须以DNA模板，在依赖于DNA的RNA POL作用下合成，他包括RNA链的起始，延

伸，终止等步骤，这一系列过程叫转录。

转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。

转录涉及两个方面

一是RNA合成的酶学过程

二是RNA合成的起始信号和终止，即DNA上的特定序列。

`

DNA和RNA的碱基序列方向总是5\'-3\'。

`

阐述几个概念：

对DNA总是讲模板链，在转录时DNA两条链有混乱不一。新文献规定：

把不作模板转录的链称为有义链（sense）又称编码链（coding）,非模板链=RNA链=有义链而把作为模板转录的链称反义链（antisense strand）或模板链,模板=反义链。

对RNA，也容易将DNA序列直接与氨基酸的密码子联系起来：

SSDNA phage 如ΦX174，其SSDNA作为复制模板进入细胞后复制合成互补DNA，后者（互补DNA）作为转录模板（即反义链）合成RNA。即SSDNA=有义链=RNA序列=正链对于SSRNA病毒，若其基因组RNA能作为mRNA或与mRNA相同，则该RNA病毒为正链RNA病毒；若其RNA进入宿主需要进行RNA复制，再产生互补链作为mRNA，则这种RNA称为负链RNA病毒。

`

`

二 RNA合成的酶学

1. RNA合成的基本特征

1) RNA的前体是四种核糖核苷三磷酸（rNTP）：ATP， GTP， CTP，UTP

2) RNA链的生长方向也是5’— 3’

3) 核苷三磷加到新生链的3\'，同时除去一分子焦磷酸而生成磷酸二酯键。

4) 转录必须以一条DNA链为模板，按碱基互补进行转录。

5) RNA POL能起始一条新链的合成，起始的核苷酸一般是嘌呤核苷三磷酸（XTP）RNA合成含四步：RNA POL结合于DNA上的特定位点，起始，链的延长，链终止和释放。

`

2. E Coli 和真核生物的RNA POL（自己看）`

`

三控制转录起始的DNA序列——操作子和启动子结构

1. 操纵元（operon）及其结构

操纵元：包括结构基因和控制区以及调节基因的整个核苷酸序列。

控制区为两部分：

1) 从结构基因溯流而上的紧靠结构基因的部分叫操作子（operator）（即结构基因的5’上游），好比电器开关，控制其后面的全部结构基因的开闭。

2) 从操作子逆行而上的就是另一控制区域，叫启动子（promoter）对转录非常重要。

`

2. 原核生物的启动子

1) Pribnow 框：—10bp处，是RNA POL 结合位点

2) Sextama 框：—35bp处，RNA pol 先结合与此处，再结合于—10bp处。

3) CAP位点：CAP为环腺苷酸受体蛋白（cyclic AMP receptor）。调节基因产生的阻遏蛋白与操纵子以及诱导物互作实现对基因转录的负调控；而葡萄糖的调控机理则为正调控。

`

3. 真核生物的启动子

真核生物有三种RNA POL：

POL I：负责转录rRNA，只有一种启动子。

POL II：负责蛋白质基因和部分snRNA基因的转录，启动子最复杂。

POL III：负责转录tRNA和5S rRNA，启动子位于转录的DNA序列内（内部启动子）。

1) RNA POL I的启动子

2) RNA POL II 的启动子结构

A. 帽子位点

B. TATA框：

C. CAAT框

D. 增强子

3) RNA POL III的下游启动子

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