主题：【第六届原创】饲料中重金属元素检测方法验证操作规程

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发表于：2012/11/03 15:04:47 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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饲料中重金属元素检测方法验证操作规程

fengxueyixiao

摘要：方法验证是实验室在选择方法时应该，而且必需做的工作，规程中讲述了方法验证内容中的标准曲线、检出限、定量限、精密度和准确度的具体做法及注意事项，在饲料行业实验室测重金属的方法验证中具有一定的指导或借鉴作用。

关键词：饲料；重金属；方法验证；规程

1 目的

对样品的测定，在选择方法时，可以优先选择国际标准方法、我国国家标准方法。对于非标准方法、本中心制定方法、超出预定范围（比如食品行业的方法拿到饲料行业用）使用的标准方法，扩充和修改过的标准方法都需要对方法进行验证，既进行方法性能检验，证明所选方法符合分析要求、切实可行，满足客户要求。

2 方法验证内容

方法验证内容主要有标准曲线、检出限、定量限、精密度和准确度。

2.1 标准曲线

采用仪器对方法进行检验时，首先要建立样品和仪器之间的关系。通常采用标准曲线来表示，利用不少于5点（不包括原点）的实验数据算出待测物和仪器响应值之间的线性回归方程并计算相关系数（r）：以待测物的绝对量（如ug）或浓度（如ug/mL）为横坐标，响应值（吸光度或荧光强度）为纵坐标制作标准曲线，确定线性范围，线性相关系数应该大于0.9990.本实验室要求原子吸收火焰法r>0.9990,石墨炉法r>0.9950，原子荧光光度法r>0.9990

在做方法验证之前，我们首先得知道样品中重金属元素的限度（如蛋鸡浓缩饲料中铅的限度为13mg/kg），根据样品的性质及仪器的灵敏度等因素，然后确定线性范围，线性范围中最高点的标液浓度一般是重金属元素的限度浓度的1~2倍，这是比较关键的一步。例子：称2g蛋鸡浓缩饲料,经炭化、灰化，酸溶解处理后，定容到50mLA级容量瓶中，如果样品中铅的含量为铅的限量13mg/kg，那么样品中的浓度为0.52ug/mL，设定标液曲线范围的最高点浓度为1.0ug/mL，由于大部分样品的含量都在铅的限量13mg/kg以下，所以按照称样量为2g,定容到50 mL，线性范围为0~1.0ug/mL是比较合适的。

标准曲线配制步骤（以铅标准曲线配制方法为例）：

（1）用移液枪取1mL购买的铅1000ug/mL标准溶液定容到100mLA级容量瓶中，加入2mL6mol/L盐酸，用超纯水定容，摇匀，得到10ug/mL铅标准储备液；

（2）用5mL刻度移液管分别取0mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、5mL10ug/mL铅标准储备液到6个50mLA级容量瓶中，在各个50mLA级容量瓶中加入1mL6mol/L盐酸, 用超纯水定容，摇匀，得到0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0ug/mL铅标准工作液

（3）将标准工作液导入原子吸收分光光度计，用超纯水调零，在283.3nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线（仪器可以自动进行绘制标准曲线）。

2.1.1标准曲线配置注意事项

(1)首先要确定标准曲线的范围，可以从重金属的限值入手，GB 13078-2001饲料卫生标准中，多种饲料及原料的限值如下：

然后调整称样量，如果按照磷酸盐中铅最大限值30mg/kg，称取1g磷酸盐样品，处理后定容到50mL,那么样品溶液浓度为0.6ug/mL，由于大部分的饲料及饲料原料含重金属的量都要比限值低，所以要灵活调整标准曲线的范围，或者称样量的大小。

（2）要考虑仪器测量该金属元素的灵敏度，如果测量该元素的灵敏度低，可以适当的增加称样量，减少定容体积，增大标准曲线溶液的浓度。相反，如果该元素的灵敏度高，要相对减少称样量，增大定容体积，必要的时候进行稀释。

（3）如果样品含量较高（需要经验），在称样时和定容时应该考虑最好使样品溶液的浓度落在标准曲线的1/3~2/3的浓度范围，在这个范围时，测量的准确性和精密度相对较高。

（4）配制标准曲线时，尽可能使用校正过的移液枪、移液管、容量瓶，标准溶液中间储备液在配制好后放置一段时间（一般我经验为10~20min）再稀释成标准曲线系列工作溶液。

（5）在稀释标准溶液，配制标准系列时，一般使用同一个移液枪或者刻度移液管进行稀释，保证相同的偏差，有利于配制出相关系数较好的标准系列工作液。

2.2 检出限
检出限是评价一个分析方法重要指标, 是指某一特定分析方法,在给定的显著性水平内,可以定性地从样品中检出待测物质的最小浓度或最小量。

检出限用于考虑方法是否具备灵敏的检测能力。常根据检测对象、检测目的的不同对检测方法的检出限作出具体规定。

因为重金属属于卫生指标中违禁使用物质，分析方法的检出限应该足够低。本规程指定检出限等于3倍样品空白的标准偏差（S）除以标准曲线斜率得到的值。

方法检出限测定步骤（以铅检出限为例）：

（1）在每次检测时，都要制作铅的样品空白（试剂空白，既除了不加标准溶液以外，其他试剂与酸的量与处理样品的相同）

（2）将仪器各参数调至正常工作状态，用超纯水调零，测试铅标准系列：0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0ug/mL铅标准工作液，软件中设定对每个浓度点分别进行三次吸光度读数测定，按照仪器软件给定的工作曲线，得到工作曲线的斜率（b）。

（3）用超纯水调零后，对铅的一个样品空白进行20次连续测定，记录下吸光度值，计算20次空白样品吸光度值的标准偏差（s）。

（4）根据公式：

式中：C_L----方法的检出限；

K-----置信因子，一般取3；

S-----样品空白标准偏差（测定20次）；

b-----工作曲线斜率。

2.2.1做检出限注意事项

（1）由于不能或很难找到一个完全和样品基体完全一致，却不含待测元素的空白样品，所以一般使用试剂空白作为样品空白，试剂空白参与前处理全过程，可以对整个前处理中试剂、水、器皿等污染情况起到监控作用。

（2）检出限的计算方法有多种，应该按照对应的方法和仪器进行选择，通常为了能够反映分析方法在整个分析处理过程的误差，可采用已知结果的标准物质或者样品按照分析步骤进行测量，通过分析12份已知结果的实际样品来计算方法的检出限，计算公式如下：

（3）如果所测元素灵敏度低（吸光度小,有可能样品空白吸光度值接近0），可以参考（2）的检出限计算方法，选择一个浓度低（一般为检出限的3~10倍），稳定性和均匀性都较好的样品进行检出限测定。

（4）检出限单位的统一，测出来的检出限的单位要与标准曲线系列的浓度单位相一致，比如标准溶液的浓度是ug/mL，检测限的单位也是µg/mL，如果要换算成mg/kg，可以乘以相对应的称样量和定容体积。假如原子吸收火焰法测铅检出限浓度=0.03ug/mL，称样量为1.0000g,定容体积为50mL，那么该方法铅的检出限=0.03 *50 /1=1.5mg/kg。

2.3 定量限

定量限是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。

定量限可确定为标准曲线的最低点浓度，或等于10/3倍检出限，理想情况下其测定值的相对标准偏差为10%以下。

2.3.1做定量限注意事项

（1）定量限如果是确定为标准曲线的最低点浓度，那么这个最低点的浓度一般为检出限的3~6倍为宜，且7次连续测定值的相对标准偏差在10%以下

（2）定量限确定后，也要选择与定量限浓度相近的样品进行测量，并测量7个平行样的浓度，其相对标准偏差在10%以下。

2.4 准确度

准确度：样品中待测物测定值（结果）与被测量真值或约定真值间的一致程度，以误差来表示。它用来表示系统误差的大小。

在实际工作中，通常用重复分析标准物质（实物标样）或加标回收实验进行方法准确度评定。通常标准物质（实物标样）比较贵，而且与样品基体相近的标准物质一般很少，故本实验室常用加入被测定组分的纯物质进行回收试验来估计和确定准确度。

用添加标准溶液的方法测定方法回收率，原则上添加的浓度以接近样品中待测物质的浓度为宜，一般为样品浓度的0.5~2.0倍，而且样品浓度和添加的浓度之和不超过标准曲线线性范围的十分之九。所以在选择加标样品时，要考虑到样品的浓度范围(一般为标准曲线线性范围的三分之一处为宜)。

样品加标回收方法操作步骤（以铅为例）；

（1）选择稳定性，均匀性较好，代表性强，浓度适合的样品，如测铅时，选择鸭饲料样品（已经测过的，含量为10mg/kg）。

（2）称取2g鸭饲料(处理后定容到50mL容量瓶中，浓度为0.4ug/mL)共17个平行样品，其中15个分成三组，每组5个平行样，第一组加入0.5mL20ug/mL铅标准储备液,加标量为10ug，加标浓度相当于0.2ug/mL；第二组加入0.75mL20ug/mL铅标准储备液,加标量为15ug，加标浓度相当于0.3ug/mL；加入1mL20ug/mL铅标准储备液,加标量为20ug，加标浓度相当于0.4ug/mL。加标后的三组样品理论上总浓度分别为0.6、0.7 0.8ug/mL。

（3）未加标和加标后的鸭饲料样品按照方法的前处理步骤进行处理（如果是用干灰化法，则进行炭化、灰化，酸溶解）

（4）处理好的鸭饲料样品，导入原子吸收测定，得到加标和未加标鸭饲料样品中铅的测定浓度；

（5）根据加标回收率公式：

本实验室对于回收率的要求，参照GBT 27404-2008 《实验室质量控制规范-食品理化检测》中的附录F，如下表

2.4.1做准确度实验注意事项

（1）在选择加标样品时，一般选择均匀性、稳定性良好，易保存的样品，如果是固体样品，最好在使用前进行适当烘干

（2）加标的标准溶液，要提前配制好，并且用加标后留下的标准溶液配成标准曲线系列工作液，保证加标标液与曲线标液的母体一致。

（3）如果条件允许，资金充足，可以购买到与测量样品基体相同或相近的标准物质，则可用标准物质作为样品，在不同时间进行多次测定，其测量值在标准值规定范围内(当测量值不在标准值规定范围内时，也可以使用En值法对结果进行判断)，则表示此方法准确性高。

（4）方法比对，新方法与国标方法对同一个样品进行分析，分别取6个以上平行样，分别用新方法和国标法进行测定，得到两组数据，分别用F检验法和t检验法对两个方法的精密度与系统误差进行显著性差异分析。

2.5 精密度

精密度是指分析方法重复测定同一样品所得测定值间的一致程度。精密度一般用重复性和再现性衡量，以相对标准偏差（RSD）表示。

在同一实验室，由同一个分析人员使用相同的设备和试剂，按照相同的方法测定所得结果的精密度称为重复性；在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度，称为中间精密度；在不同实验室，由不同分析人员使用不同相同的设备和试剂，按照相同的方法测定所得结果的精密度，称为重现性。

2.5.1 重复性

重复性也叫平行性，由于相对标准偏差和待测物浓度相关，在进行样品中待测物室内RSD测定时，需要选择不同浓度的样品，一般为标准曲线线性范围的1/10（低）、1/2（中）、9/10（高）的浓度，三个不同浓度的样品，每个取6个以上平行样进行连续测定，计算其相对标准偏差（RSD）

重复性测定步骤（饲料中测铅为例）:

(1)取浓度为0.1、0.5、0.9ug/mL（定容到50mL后）的不同饲料样品，分别称取8个平行样；

(2)根据方法的前处理步骤将样品处理好

(3)将处理好的饲料样品，导入原子吸收分光光度计测定，记录下各个浓度下8个平行样的浓度值；

(4)计算相对标准偏差RSD，公式：

2.5.2 中间精密度
为考察随机变动因素对精密度的影响，应设计方案进行中间精密度试验。变动因素为不同时间、不同分析人员、不同设备。不同时间，不同分析人员，不同设备这三项中有一项即可，因为很多实验室测量同一个项目只有一台设备，所以在实际应用中中间精密度多为不同时间和不同分析人员。测试方法与重复性测定方法相同。
2.5.3 重现性

重现性也叫再现性。在制定方法时，则由3到5个不同实验室进行验证。

验证步骤（饲料中测铅为例）：

（1）取3个低、中、高不同浓度水平的饲料样品送往3到5家实验室进行测定；

（2) 要求每个浓度称取5个平行样，每个平行样重复测试不少于3次；

（3）本实验室的检测结果、其他实验室的检测结果相对标准偏差（RSD）值不可以大于表3中重现性（RSD/%）要求。

实验室内部或不同实验室间的验证试验，对不同浓度的精密度要求参考GB/T23182-2008《饲料中兽药及其他化学物检测试验规程》5.3中的内容见表3

在做饲料中金属元素的方法验证时，要求要做到上面所提到的标准曲线、检出限、定量限、准确度、精密度五项内容，如果有特殊要求的方法，还需要做相对应其他方面的验证内容。

2.5.4 做精密度实验注意事项

（1）重复性试验应该安排多种样品（比如鸭饲料，猪适量，鱼饲料）的测试，保证新方法的适用范围，计算高、中、低浓度的相对标准偏差。

（2）做日间精密度分析一定要选择均匀性、稳定性良好，易保存的样品，一般不选脂肪含量高（比如肉骨粉、鱿鱼膏），水分高的样品。保证样品有足够的量，粉碎后的样品要过40目筛，做好标示，密封保存在4~8℃冰箱中。

（3）日间精密度实验周期可以根据不同的测试项目和样品要求灵活改变，一般是两周，每周安排3~5天测试样品的重复性，两周共测试6~10次，记录每组数据的值，计算每组的RSD和各个浓度样品含量的平均值，再计算6~10次样品含量平均值的RSD(即日间RSD)。

（4）重现性测试中，不同的实验室包括分公司实验室、同行实验室、第三方检测机构实验室等，测试样品为同一个样品，指定分析方法为本实验室制定方法，要求各实验室高、中、低浓度样品各取5个平行样，报告结果的RSD和平均值，再比较本实验室结果与其他实验室两个结果间的RSD，要求满足表3中的规定。

3 参考文献

[1]GB/T23182-2008《饲料中兽药及其他化学物检测试验规程》

[2]GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》

[3]JJG 694-2009 《原子吸收分光光度计检定规程》

[4]田强兵.分析化学中检出限和测定下限的探讨[J]

以上小文是我根据自己的经验和参考资料，还有借鉴了wmj31老师的线上讲座213期《药品中无机杂质限度的制定及分析方法验证（二）》写的，在此非常感谢wmj31老师的指导。由于自己理论知识和实践经验不足，写作水平低，文中必定存在不少的漏洞与缺陷，欢迎各位专家和版友批评指正，这篇小文章实属抛砖引玉，希望各位专家和版友能够分享在方法验证方面的经验，特别是具体的操作步骤和数据判断的依据，以及数据的统计处理。

11.25日补加了验证内容的注意事项，请各位专家和版友批评指正。