主题：【第六届原创】建立测定某多肽HPLC法

建立测定某多肽HPLC法

    多肽是人体自身存在而且必需的活性物质，是人体的重要组成物质、营养物质，它广泛分布于人体各部位，特别是在大脑里，几乎对所有的细胞都有调节作用。人体缺失了多肽，免疫系统及各功能系统就可能发生紊乱，就会出现各种慢性病。多肽还具有抗菌、抗肿瘤、增强传统抗生素对耐药菌的活性、促进创伤愈合等多项生物学功能。这也就成为其在医药、食品防腐、保健品及化妆品等领域具有广阔的应用前景。

    蛋白质的生理功能主要由肽来完成，有人甚至说肽是生命的统帅，对生命非常重要。所以肽及多肽的生产、合成也是非常重要的。当然测定工作也是很重要的。

    某药物研究所通过药物机理成功的合成了某营养成分--某多肽，由于涉及到一些保密成分，暂时定义为“多肽X”。以下测定实验就是一是为了测定多肽，二是为了通过对某药品中多肽的测定，以便对该多肽成分制备提取提供可行性方法及理论数据。

1  实验概述

1.1  实验目的

a.为了测定多肽。

b.为了通过对某药品中多肽的测定，以便对该多肽成分制备提取提供可行性方法及理论数据。

1.2      实验要求

a.  梯度基线漂移不超过20mAu,分离度好。

b.  定性定量分析结果准确可靠。

c.  通过对某药品中多肽的测定，完善色谱条件(主要是流动相和检测波长的确定)，为该多肽X的制备提取做工作。

1.3      实验原理

以乙腈和水为流动相，加入阴离子对试剂三氟乙酸，与多肽的质子化氨基结合，以提高多肽样品的保留值。

1.4      实验环境

1.4.1仪器设备：

高效液相色谱仪(梯度洗脱泵，紫外检测器)

手动进样器

1.4.2环境：

温度：24℃

湿度：45%

2  实验方案

2.1色谱条件（参考）：

色谱柱：STC C18（250*4.6，5um）

波长：210nm

流动相A：0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液

流动相B：0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液



流速：1.0ml/min

进样量：10µL

柱温：室温



2.2思路：

做空白基线，基线不合格，优化条件至合格；基线合格，做样品，优化条件至最佳。

3  实验步骤

3.1      空白基线

3.2      样品测定

4  实验数据及分析

4.1多肽X对照品（自制的）色谱图：





4.2空白基线谱图：基线较平稳，稳定在10mAu内，满足要求。



4.3多肽样品谱图：在样品出峰的位置附近基线会上漂，不理想。说明样品基质本底较高。应优化样品基质试剂。





多肽样品图与空白基线比较：





4.4将2.1色谱条件中的A流动相中三氟乙酸浓度减半（变为0.05%），降低三氟乙酸的本底吸收值，以抵消梯度过程中乙腈浓度增大造成的基线上漂。超到很好的作用，提高了样品的灵敏度，降低了本底吸收值。



流动相中三氟乙酸浓度改变前后谱图比较：

由此可见流动相A：0.05%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液效果更佳。

4.5通过以往的参考资料多肽测定的紫外最大吸收波长一般在214nm附近，280nm附近。下面就先看一下280nm和214nm紫外吸收的对照谱图：



    通过谱图可以看出214nm测定的效果显然比280nm好，这样我们就可以确定该多肽X的最佳紫外吸收波长应该在214nm处或214nm附近处。最后通过多次实验对比，我们最终确定波长在210nm处最好。



4.6色谱条件（最终）：

色谱柱：STC C18（250*4.6，5um）

波长：210nm

流动相A：0.05%三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液

流动相B：0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液



流速：1.0ml/min

进样量：10µL

柱温：室温



5  实验结论

5.1由空白基线平稳得知，使用高效液相色谱法测定多肽X可行，尤其通过调整流动相中三氟乙酸的含量效果更好。

5.2检测波长的选择对于测定效果起着很重要的作用，该波长的选择非常合理。

5.3减少流动相乙腈中的三氟乙酸的含量，可以部分抵消由乙腈在梯度过程中含量增加吸收背景增加而造成的基线上漂，并增加了主峰的灵敏度。

5.4三氟乙酸浓度的改变没有改变多肽的保留时间。

5.5该方法测定该多肽X结果准确，重复性很好。

6  注意

6.1三氟乙酸（TFA）腐蚀性强，实验中一定要带手套，完毕后要及时彻底洗手。

6.2该多肽X不稳定，时间长或温度高光照强会发生不确定的变化，测定过程中要注意。

6.3实验中提取的该多肽X只能用于实验，不能直接添加到食品、保健品等中，因为该物中残留有乙腈等化学品。